Un test funzionale di sangue intero per misurare la vitalità dei micobatteri, utilizzando Reporter-Gene Tagged BCG o M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Summary

Abbiamo descritto un approccio alternativo alla enumerazione dei micobatteri<em> In vitro</em>, Che utilizza giornalista-gene tag micobatteri invece di unità formanti colonie (CFU). "Sopravvivenza" degli organismi così come risposta dell'ospite-marcatori vengono misurati contemporaneamente, fornendo un basso costo, sistema versatile e funzionale per gli studi di host / patogeno interazioni nel contesto della tubercolosi.

Abstract

Test funzionali hanno a lungo avuto un ruolo chiave nella misurazione di immunogenicità di un vaccino somministrato. Questo è convenzionalmente espresso in titoli battericida del siero. Studi di siero titoli battericida in risposta a vaccini per l'infanzia ci hanno permesso di sviluppare e convalidare i livelli di cut-off per la risposta immunitaria protettiva e tale cut-off sono in uso di routine. Nessun tali analisi sono state prese in avanti nella valutazione di routine dei vaccini che inducono soprattutto immunità cellulo-mediata in forma di risposte delle cellule T effettrici, come i vaccini TB. Nel modello animale, le prestazioni di un candidato vaccino somministrato di routine è valutato in test standardizzati battericida, e tutti gli attuali romanzo TB-vaccino candidati sono stati sottoposti a questo passo nella loro valutazione prima della fase 1 sperimentazione umana. La valutazione di immunogenicità e quindi probabilità di efficacia protettiva del romanzo di vaccini anti-TBC dovrebbe idealmente subire una simile graduale valutazione nei modelli umani oggi, comprese le misurazioni in saggi battericida.

Test battericida nel contesto della ricerca tubercolosi vaccino sono già ben radicate nei modelli animali, dove sono applicati a schermo vaccini candidati potenzialmente promettenti. Riduzione della carica batterica nei vari organi funzioni come il principale lettura di immunogenicità. Tuttavia, non tali dosaggi sono stati inseriti nella sperimentazione clinica per il romanzo anti-TB vaccini fino ad oggi.

Anche se c'è ancora incertezza circa i meccanismi esatti che portano alla morte dei micobatteri all'interno dei macrofagi umani, l'interazione dei macrofagi e delle cellule T con micobatteri è chiaramente necessario. Il dosaggio descritti in questo documento rappresenta una nuova generazione di test battericida che consente studi di tali componenti chiave cellulari con tutti gli altri fattori cellulari e umorali presenti nel sangue intero senza fare ipotesi sulla loro contributo relativo individuali. Il test descritto dal nostro gruppo utilizza piccoli volumi di sangue intero ed è già stato impiegato in studi di adulti e bambini in TB è endemica impostazioni. Abbiamo dimostrato immunogenicità del vaccino BCG, aumento della crescita dei micobatteri in pazienti sieropositivi, così come l'effetto della terapia anti-retrovirale e vitamina D sulla sopravvivenza dei micobatteri in vitro. Qui riassumiamo la metodologia, e presentare i nostri dati riproducibilità utilizzando questo modello relativamente semplice, a basso costo e di campo-friendly.

Nota: Definizioni / Abbreviazioni

BCG lux = M. bovis BCG, ceppo Montreal, trasformato con il plasmide pSMT1 navetta che trasportano i geni luxAB dal Vibrio harveyi, sotto il controllo dei micobatteri GroEL (hsp60) promotore.
UFC = unità formanti colonia (una misura della vitalità dei micobatteri).

Protocol

1. Preparazione del giornalista BCG magazzino lux micobatteri Crescere BCG lux (M. bovis BCG ceppo Montreal trasformato con il plasmide pSMT1 navetta) con agitazione a 200gpm a metà logaritmica fase Middlebrook 7H9 brodo glicerolo contenente 0,2%, 0,05% Tween 80 e il 10% di arricchimento ADC. Preparare 1 ml di una diluizione 1:10 di cultura BCG lux in PBS sterile in un tubo luminometro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) in duplice copia. Carico prove…

Discussion

Test battericida nel contesto della ricerca tubercolosi vaccino sono ben stabiliti nei modelli animali, dove sono applicati a schermo vaccini candidati potenzialmente promettenti. Riduzione della carica batterica nei vari organi funzioni come il principale lettura di immunogenicità.

La prima generazione di umani test battericida sono stati progettati utilizzando macrofagi da solo, infettati con M. tubercolosi. CFU servita come principale lettura di sopravvivenza dei micobatteri dop…

Materials

Reagent	Company	Cat No
BCG lux	Various	n/a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichment	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplement	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glycerol	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma	D7384-100G
Ethanol (>99.7%)	VWR	101077
Sterile PBS	In House	n/a
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES	Sigma	R0883
Sterile distilled Water	In House	n/a
Equipment
Tube luminometer (injectable port mandatory)	Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless	Corning from VWR	99445-12
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin)	BD	367676
50ml Falcon tubes, conical	BD	352077
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes	VWR	99445-12
Sterilin Universal containers (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Glass beads 2mm diameter	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipettes and pipette boy	any
1000μl and 200μl pipettes and filter tips	any
General laboratory equipment:
Class II safety cabinet cabinet
Refrigerator (4°C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures