Her beskriver vi en protokoll for utarbeidelse av agar-embedded retinal skiver som er egnet for elektrofysiologi og Ca2 + bildebehandling. Denne metoden gjør det mulig å studere bånd-type synapser i retinal microcircuits bruke direkte patch-clamp opptak av single presynaptiske nerveterminaler.
Visuelle stimuli er oppdaget og formidlet over et bredt dynamisk spekter av lys intensitet og frekvens endres med spesialisert nevroner i virveldyr netthinnen. To klasser av netthinnens nerveceller, fotoreseptorene og bipolare celler, oppnår dette ved hjelp av bånd-type aktive soner, som muliggjør vedvarende og høy gjennomstrømning nevrotransmitter utgivelse over lange tidsperioder. ON-typen blandet bipolar celle (Mb) terminaler i gullfisk netthinnen, som depolarize til lys stimuli og motta blandet stang og kjegle fotoreseptoren innspill, er egnet for studiet av bånd-type synapser både på grunn av sin store størrelse (~ 10-12 mikrometer diameter), og deres tallrike lateral og gjensidige synaptiske forbindelser med amacrine celle dendritter. Direkte tilgang til Mb bipolar celle terminaler i gullfisk retinal skiver med patch-clamp teknikken tillater måling av presynaptisk Ca 2 + strømmer, membran kapasitans endringer, og gjensidig synaptisk feedback-hemming mediert av GABA <sub> A og GABA C reseptorer uttrykt på terminalene. Presynaptisk membran kapasitans målinger av eksocytose tillate en å studere den kortsiktige plastisitet av eksitatoriske nevrotransmitter utgivelsen 14,15. I tillegg kan kortsiktige og langsiktige plastisitet av inhibitoriske nevrotransmitter løslatelse fra amacrine celler også bli etterforsket av innspillinger av gjensidige tilbakemeldinger hemming ankommer Mb terminal 21. Over korte perioder av gangen (f.eks ~ 10 s), gjennomgår gabaergic gjensidig feedback-hemming fra amacrine celler parvise puls depresjon via GABA vesicle bassenget uttømming 11. Den synaptiske dynamikk retinal microcircuits i indre plexiform laget av netthinnen kan dermed være direkte studert.
Hjernen-slice teknikk ble introdusert mer enn 40 år siden, men er fortsatt svært nyttig for etterforskningen av de elektriske egenskapene til nevroner, både på enkelt celle soma, single dendrite eller axon, og microcircuit synaptiske nivå 19. Vev som er for små til å være limt direkte på slicing kammeret er ofte første innebygd i agar (eller plasseres på et filter papir) og deretter skiver 20, 23, 18, 9. I denne videoen, ansetter vi pre-embedding agar teknikk med gullfisk netthinnen. Noen av de gigantiske bipolar celle terminaler i vår skiver av gullfisk netthinnen er axotomized (axon-cut) under kutting prosedyren. Dette gir oss muligheten til å isolere enkelt presynaptisk nerve terminal innganger, fordi opptak fra axotomized terminaler utelukker signalene fra de soma-dendrittiske kupé. Alternativt kan man også ta opp fra intakt Mb bipolare celler, med opptak fra terminaler festet til axoner som ikke har blitt kuttet under kutting prosedyren. Totalt sett vil bruk av denne forsøksprotokollen hjelpemiddel i studier av retinal synaptic fysiologi, microcircuit funksjonell analyse, og synaptisk overføring på bånd synapser.
En kritisk og vanskelig skritt i protokoll vårt er overføring av del av netthinnen inn i agar løsningen (protokoll 3.4). Det er nødvendig å forsiktig fjerne glasslegemet og rester slice løsning fra retinal stykke og overføre det uten forvrengning eller bøyd. For å oppnå dette bruker vi en liten slikkepott (21-401-25B, Fisherbrand) med et tips bøyd i en 90 ° vinkel, sammen med vinklet spiss tang (11251-35, Fine Science Tools), å plassere retinal stykke gjennom overføringsprosessen i skive l…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Fred Rieke for hans slags forklaring av agar-embedded retinal slice forberedelse da vi begynte å bruke protokollen i vårt laboratorium. Vi takker også Lori Vaskalis for illustrasjon av skjematisk oversikt og Drs. Veeramuthu Balakrishnan og Soyoun Cho for nyttige kommentarer til tekst og video. Dette arbeidet ble støttet av en NEI-NIH RO1 stipend, og var også delvis støttet av en Korea Research Foundation Grant finansiert av den koreanske regjeringen [KRF-2008-357-E00032].
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
Vertical puller | Narishige | PP830 | |
Dental wax | Cavex | ||
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
CCD camera | Sony | XC-75 | |
Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |