Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Summary

Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di agar-embedded fette della retina che sono adatti per elettrofisiologia e Ca2 + imaging. Questo metodo permette di studiare nastro di tipo sinapsi in microcircuiti della retina mediante diretta patch-clamp registrazioni dei singoli terminali nervosi presinaptici.

Abstract

Stimoli visivi vengono rilevati e inoltrato su una ampia gamma dinamica di intensità di luce e variazioni di frequenza dai neuroni specializzati nella retina dei vertebrati. Due classi di neuroni della retina, fotorecettori e cellule bipolari, ottenere questo risultato utilizzando zone attive nastro tipo, che consentono il rilascio dei neurotrasmettitori sostenuta e high-throughput per periodi di tempo lunghi. ON-cellula bipolare di tipo misto (Mb) terminali nella retina pesci rossi, che depolarizzare agli stimoli luminosi e ricevere asta mista e di ingresso dei fotorecettori cono, sono adatti per lo studio delle sinapsi, sia a causa delle loro grandi dimensioni nastro di tipo (~ 10-12 micron di diametro) e per le loro numerose connessioni laterali e reciproca sinaptica con dendriti delle cellule amacrine. Accesso diretto ai terminali Mb cellule bipolari a fette pesci rossi della retina con la patch-clamp consente la misurazione di Ca ^{2 +} presinaptico correnti, variazioni di capacità della membrana, e reciproca inibizione di feedback sinaptica mediata dal GABA <sub> recettori GABA A e _C espresso sui terminali. Presinaptico misure membrana capacità di esocitosi permettono di studiare a breve termine plasticità del rilascio di neurotrasmettitore eccitatorio ^14,15. Inoltre, la plasticità a breve termine ea lungo termine del rilascio di neurotrasmettitore inibitorio da parte delle cellule amacrine possono anche essere indagato da registrazioni di inibizione reciproca di feedback che arrivano al terminal Mb ^21. In brevi periodi di tempo (ad esempio ~ 10 s), GABAergici inibizione di feedback reciproco a partire da cellule amacrine subisce accoppiato impulsi depressione attraverso l'esaurimento GABA piscina vescicola ^11. La dinamica sinaptica di microcircuiti retina nello strato plessiforme interno della retina può quindi essere direttamente studiato.

Il cervello-fetta tecnica è stata introdotta più di 40 anni fa ma è ancora molto utile per lo studio delle proprietà elettriche dei neuroni, sia a singola cellula soma, dendriti singolo o assone, e microcircuit livello sinaptico ^19. Tessuti che sono troppo piccole per essere incollato direttamente sulla camera di taglio sono spesso incorporati in prima agar (o la collocazione in una carta da filtro) e poi a fette ^{20, 23, 18, ​​9.} In questo video, ci avvaliamo di pre-embedding tecnica di agar con retina pesci rossi. Alcuni dei giganti terminali delle cellule bipolari nelle nostre fette di retina pesci rossi sono axotomized (assone-cut) durante la procedura di taglio. Questo ci permette di isolare singoli ingressi terminale nervoso presinaptico, perché la registrazione da terminali axotomized esclude i segnali dal soma-dendritiche vano. In alternativa, si può anche registrare da intatto Mb cellule bipolari, registrando dai terminali collegati a assoni che non sono stati tagliati durante la procedura di taglio. Nel complesso, l'uso di questo protocollo sperimentale sarà di aiuto negli studi di fisiologia sinaptica della retina, l'analisi funzionale microcircuito, e la trasmissione sinaptica di sinapsi nastro.

Protocol

1. Soluzioni interne ed esterne

1. Preparare la soluzione per affettare (calcio) dalla soluzione madre 10x e aggiungere MgCl _2, CaCl ₂ e D-glucosio tutti i giorni. La soluzione finale è costituito da 1x (in mm): 119 NaCl, 2.5 KCl, 3.2 _MgCl2, 0,25 CaCl _2, 12 D-glucosio, 0,2 acido L-ascorbico, 12 HEPES. Impostare il pH a 7.4 (con NaOH), e regolare osmolarità di 260 mOsm (con H ₂ O e la soluzione madre 10x).
2. Pesare il 3% a bassa temperatura gelificante agar (agarosio tipo VII-A, A0701, Sigma, Rieke, 2001) e mescolare con taglio soluzione. Riscaldare la soluzione contenente agar in un forno a microo....

Discussion

Un passo importante e difficile nel nostro protocollo è il trasferimento del pezzo di retina nella soluzione di agar (protocollo 3.4). E 'necessario rimuovere con attenzione il vitreo e la soluzione fetta residua dal pezzo della retina e trasferirlo senza distorsioni o piegature. Per fare questo, usiamo una piccola spatola (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta piegata a formare un angolo di 90 °, insieme con una pinza punta angolata (11251-35, Strumenti Scienza Fine), di posizionare la retina pezz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bassa temperatura gelificante agar	Sigma	A0701	Agarosio tipo VII-A
Patch pipetta	Mondo Strumenti di precisione	1B150F-4	Pareti spesse (1,5 mm di diametro esterno) in vetro borosilicato
Estrattore verticale	Narishige	PP830
Impronte dentarie	Cavex
Primavera forbici	Strumenti Scienza multa	15003-08
45 ° angolato pinze punta fine	Strumenti Scienza multa	11251-35
Lametta	Personna		Doppio taglio, puliti con etanolo al 70% e H 2 O
Tubo cilindrico	Fisherbrand	03-338-1B	Polietilene fiale campione 2,5 ml
Ialuronidasi	Sigma	H6254
Vibratome affettatrice	Leica	VT1000S o VT1200S
Microscopio verticale	Olimpo	BX51WI
60x acqua-immersion obiettivo	Olimpo	LUMPlanFl	NA 0,90
Telecamera CCD	Sony	XC-75
Telecamera di controllo	Hamamatsu	C2400
Monitor	Sony		13 "Monitor in bianco e nero
Siringa filtro	Nalgene		0,2 micron
Micromanipolatore	Sutter Instrument	MPC-200
Amplificatore lock-in	HEKA		EPC-9/10 amplificatori hanno software di emulazione
Spinning microscopio laser confocale disco	Yokogawa	CSU-X1	Imaging cellulare vivere dopo di patch clamp registrazione a cellula intera
Slidebook software	Intelligent Imaging Instruments (3i)		Imaging di acquisizione dati e analisi
Paraformaldeide	Sigma	P6148
Soluzione tampone fosfato	GIBCO	70013
Superfrost scivolo	Fisher Scientific		Vetrino
Agenti anti-sbiadimento	Biomeda corp.
Confocale a scansione laser microscopio	Carl Zeiss	LSM 710	Imaging del tessuto fisso
Spatola	Fisherbrand	21-401-25B
Manuel verticale Affettatrice	Narishige	ST-20
Oregon verde 488 Bapta-1	Invitrogen	O-6806	Ca 2 + colorante fluorescente sensibile
Alexa Fluor 555 IDRAZIDE	Invitrogen	A-20501MP	Colorante fluorescente