Här beskriver vi ett protokoll för beredning av agar inbäddade-retinal skivor som är lämpliga för elektrofysiologi och Ca2 + avbildning. Denna metod gör att man kan studera band-typ synapser i näthinnan mikrokretsar med direkt patch-clamp inspelningar av enstaka presynaptiska nervändslut.
Visuella stimuli upptäcks och förmedlas över ett brett dynamiskt omfång av ljusintensiteter och förändringar ofta av specialiserade nervceller i ryggradsdjur näthinnan. Två klasser av näthinnans nervceller, fotoreceptorer och celler bipolär, åstadkomma detta genom att använda band-typ aktiva zoner, som möjliggör uthållig och hög genomströmning frisättningen av neurotransmittorer under långa tidsperioder. ON-typ blandad bipolär cell (Mb) terminaler i guldfisk näthinnan, som depolarize till ljus stimuli och får blandas tappar och stavar photoreceptor ingång, är lämpliga för studier av band-typ synapser både på grund av sin storlek (~ 10-12 ìm diameter) och deras många sidled och ömsesidiga synapsförbindelser med amakrina cell dendriter. Direkt tillgång till MB bipolär cell terminaler i Goldfish retinal skivor med patch-clamp teknik möjliggör mätning av presynaptiska Ca 2 + strömmar, membran förändringar kapacitans, och ömsesidig synaptiska feedback-hämning medierad av GABA <sub> A och GABA C-receptorer uttrycks på terminalerna. Presynaptiska membranet kapacitans mätningar av exocytos tillåter en att studera den kortsiktiga plasticitet i excitatoriska neurotransmittorn släppa 14,15. Dessutom kan kortsiktiga och långsiktiga plasticitet i inhibitoriska neurotransmittorn befrielse från amakrina celler också utredas av inspelningar av ömsesidig återkoppling hämning anländer till Mb plint 21. Under korta perioder (t.ex. ~ 10 s), genomgår GABAergic ömsesidig återkoppling hämning från amakrina celler parade puls depression via GABA vesikler poolen utarmning 11. Den synaptiska dynamik retinal mikrokretsar i den inre plexiform lagret av näthinnan kan därför vara direkt studeras.
Hjärnan-slice tekniken infördes mer än 40 år sedan men är fortfarande mycket användbar för undersökning av de elektriska egenskaperna hos nervceller, både på det enda cell soma, enkel Dendrite eller axon, och microcircuit synaptisk nivå 19. Vävnader som är för små för att limmas direkt på skivning kammaren ofta först inbäddade i agar (eller placeras på ett filtrerpapper) och sedan skivade 20, 23, 18, 9. I denna video använder vi före inbäddning agar teknik med guldfiskar näthinnan. Några av de gigantiska bipolära cellen terminaler i våra skivor av guldfisk näthinnan är axotomized (axon-cut) under skärning förfarandet. Detta tillåter oss att isolera enstaka presynaptiska ingångar nervändslut, eftersom inspelning från axotomized terminaler utesluter signalerna från soma-dendritiska facket. Alternativt kan en post även från intakta Mb bipolära celler, genom att spela in från depåer knutna till axoner som inte har sänkts under skivning förfarandet. Totalt sett kommer att använda denna experimentella protokoll stöd i studierna av näthinnans synaptiska fysiologi, mikrokrets funktionell analys och synaptisk transmission på band synapser.
Ett kritiskt och svårt steg i våra protokoll är överföring av del av näthinnan i agar lösningen (protokoll 3,4). Det är nödvändigt att noggrant avlägsna glaskroppen och återstående skiva lösning från retinala pjäsen och den överförs utan förvrängning eller böjning. För att åstadkomma detta använder vi en liten spatel (21-401-25B, Fisherbrand) med en spets böjd att bilda en 90 ° vinkel, tillsammans med vinklad spets pincett (11.251-35, Fine Science Tools), att placera näthinnan…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Fred Rieke för hans vänliga förklaring av agar inbäddade-retinal slice förberedelser när vi började använda protokollet i vårt laboratorium. Vi tackar också Lori Vaskalis för illustration av schematisk överblick och Dr. Veeramuthu Balakrishnan och Soyoun Cho för värdefulla kommentarer på texten och video. Detta arbete stöddes av ett NEI-NIH RO1 bidrag, och var också delvis av en Korea Research Foundation som finansieras av Sydkoreas regering [KRF-2008-357-E00032].
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Low gelling-temperature agar | Sigma | A0701 | Agarose type VII-A |
Patch pipette | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass |
Vertical puller | Narishige | PP830 | |
Dental wax | Cavex | ||
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
45° angled fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Razor blade | Personna | Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O | |
Cylindrical tube | Fisherbrand | 03-338-1B | Polyethylene sample vials 2.5 ml |
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1000S or VT1200S | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
60x water-immersion objective | Olympus | LUMPlanFl | NA 0.90 |
CCD camera | Sony | XC-75 | |
Camera controller | Hamamatsu | C2400 | |
Monitor | Sony | 13” black and white monitor | |
Syringe filter | Nalgene | 0.2 μm | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MPC-200 | |
Lock-in amplifier | HEKA | EPC-9/10 amplifiers have software emulation | |
Spinning disk laser confocal microscope | Yokogawa | CSU-X1 | Live cell imaging after patch clamp whole cell recording |
Slidebook software | Intelligent Imaging Instruments (3i) | Imaging data acquisition and analysis | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffer solution | GIBCO | 70013 | |
Superfrost slide | Fisher Scientific | Slide glass | |
Anti-fading agents | Biomeda corp. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | Imaging of fixed tissue |
Spatula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
Manuel vertical slicer | Narishige | ST-20 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca2+ sensitive fluorescent dye |
Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A-20501MP | Fluorescent dye |