胚胎腹侧中脑器官型片文化：一个系统来研究多巴胺能神经元发展在体外</em
Summary
描述一个方法来生成从E12.5小鼠胚胎脑器官切片。可用于器官切片文化观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑的神经元的行为。
Abstract
鼠标是一个很好的的模式生物研究哺乳动物大脑的发展，由于大量的分子和基因数据。然而，发展中国家的小鼠大脑是不容易操纵和体内成像合适，因为小鼠胚胎是交通不便，不透明。器官型胚胎的大脑切片文化，因此被广泛用于研究在体外培养的小鼠大脑发育 。体外操纵或允许使用的转基因小鼠基因表达的修改，所以可以用荧光蛋白标记的神经元或神经胶质细胞的亚群。标记细胞的行为，然后可以使用时间推移成像观察。已定时成像研究细胞行为背后晚1-2萌芽阶段大脑皮层的发展，特别是成功。胚胎器官的大脑区域以外的前脑切片在文化系统较差establisHED。因此，时移成像数据描述了神经细胞迁移的财富，是仅限于前脑3,4。它仍然是不知道，是否背的大脑中发现的原则腹脑区的真实。在腹侧的大脑，神经元是神经元集群，而不是层组织，他们往往要经过复杂的迁徙轨迹，以达到他们的的最终位置。腹脑不仅是一个腹侧大脑发育良好的模型系统，也包含如多巴胺能神经元疾病过程中的有关神经元的人口。虽然功能和多巴胺能神经元变性一直在成人和脑老化的非常详细的调查，很少有人知道这些神经元的行为在其分化和迁移阶段5。我们在这里描述从胚胎一天（五）12.5鼠腹侧中脑切片培养的一代。这些切片邪教URES有可能适合监测在体外几天的多巴胺能神经元发展。我们强调在胚胎发育的早期阶段产生的脑切片的关键步骤， 并讨论保持在体外培养的多巴胺能神经元的正常发展的必要条件。我们也可以从时间的推移成像实验结果。在这些实验中，被打成腹侧中脑前体（包括多巴胺的前体）和他们的后裔在镶嵌的方式，使用一个基础的Cre / loxP位诱导的命运映射系统 6 。
Protocol
Discussion
这里介绍的器官切片培养方法在体外分析发展中国家在胚胎腹侧中脑多巴胺能神经元和它们的迁徙和投影路线系统提供了一个短期的。我们发现，有一些在协议的重要步骤应仔细出席了会议，以获得片，使腹侧中脑多巴胺能神经元的正常发展。最关键的一步是胚胎脑，快速和精确的解剖。相比之下一代成人的大脑切片，这是关键部分的大脑上配有一个冷却系统，使用频率低，与高速结合，?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢他们在帮助建立器官切片培养体系和沃尔夫冈夜蛾和批判性阅读的手稿Liviu加布里埃尔Bodea马汀娜Emond和伊莎贝尔Brachmann。我们要感谢弗兰克Costantini的R26记者小鼠和SHH CreER小鼠的克里夫塔宾。这项研究是从科学和北莱茵 – 威斯特法伦州（Programm楚Förderung DER Rückkehr DES wissenschaftlichen Spitzennachwuchses AUS DEM Ausland）的研究部资助的一个研究奖。
Materials
Table of specific reagents and equipment
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucose 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | prepare 200mM stock and store at -20°C |
| UltraPure LMP agarose | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-dish 35 mm, low | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Razor Blade | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl glue | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Perforated Spoon Dia diameter 15 mm |
Fine Science Tools | 10370 -18 | |
| Forceps 5 Dumoxel | Fine Science Tools | 11252 – 30 |
Antibodies used for immunostainings:
| Name of the antibody | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | AB152 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-tyrosine hydroxylase | Millipore | MAB318 | Dilution 1:500 |
| Mouse anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Dilution 1:200 |
| Rabbit anti-cleaved caspase 3 | Cell Signaling Technology | 9661 | Dilution 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Dilution 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Dilution 1:200 |
Riferimenti
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