Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.
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Articolo metodologico
Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il mouse è un organismo modello eccellente per studiare lo sviluppo del cervello dei mammiferi a causa della abbondanza di dati molecolari e genetici. Tuttavia, il cervello di topo in via di sviluppo non è adatto per una facile manipolazione e di imaging in vivo in quanto l'embrione del mouse è inaccessibile e opaco. Culture fetta organotipica di cervelli embrionali sono quindi ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cervello murino in vitro. Ex-vivo, la manipolazione o l'uso di topi transgenici permette la modifica dell'espressione genica in modo che le sottopopolazioni di cellule neuronali e gliali possono essere etichettati con proteine fluorescenti. Il comportamento delle cellule etichettate possono essere osservate con time-lapse imaging. Time-lapse imaging è stata particolarmente efficace per lo studio dei comportamenti delle cellule che sono alla base dello sviluppo della corteccia cerebrale a fine fase embrionale 1-2. Embrionale organotipica sistemi fetta della cultura nelle regioni del cervello al di fuori del prosencefalo sono establis menoHED. Pertanto, la ricchezza di time-lapse dati di immagini che descrivono la migrazione delle cellule neuronali è limitato al 3,4 proencefalo. Non è ancora noto, se i principi scoperti per il cervello dorsale valere per le aree del cervello ventrale. Ventrale del cervello, i neuroni sono organizzati in gruppi neuronali, piuttosto che i livelli e spesso devono sottoporsi a complicate traiettorie migratorie per raggiungere la loro posizione finale. Il mesencefalo ventrale non è solo un buon sistema modello per lo sviluppo cerebrale ventrale, ma contiene anche le popolazioni neuronali come i neuroni dopaminergici che sono rilevanti nei processi di malattia. Mentre la funzione e la degenerazione dei neuroni dopaminergici è stato studiato in grande dettaglio nel cervello adulto e l'invecchiamento, poco si sa circa il comportamento di questi neuroni durante la fase di differenziazione e migrazione 5. Descriviamo qui la generazione di culture fetta dal giorno embrionale (E) 12,5 mesencefalo ventrale del mouse. Queste fetta cultoUres siano potenzialmente idonei per il monitoraggio dello sviluppo dei neuroni dopaminergici per diversi giorni in vitro. Evidenziamo i passaggi critici nella generazione di fette di cervello in queste prime fasi di sviluppo embrionale e discutere le condizioni necessarie per mantenere il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici in vitro. Abbiamo inoltre presentare i risultati di esperimenti di imaging lasso di tempo. In questi esperimenti, precursori mesencefalo ventrale (compresi i precursori dopaminergici) ed i loro discendenti sono stati etichettati in modo mosaico utilizzando un Cre / loxP basato destino sistema inducibile mappatura 6.
Protocollo
Parti di questo protocollo sono modificate da Daza et al., 2007 7.
1. Preparativi
- Possono essere preparati un giorno di anticipo
- Preparare 1X tampone Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2.5 mM CaCl 2, 11 mM glucosio, 25 mM NaHCO 3; aggiustare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare (0,22 dimensione dei pori micron) e conservare a 4 ° C.
- Preparare il terreno di coltura (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml di glucosio DMEM alto, 850 ml di glucosio al 30%, 5 ml di siero di cavallo (2....
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Discussione
Il metodo organotipica cultura fetta qui presentato fornisce un sistema di breve termine in analisi in vitro di neuroni dopaminergici e sviluppare le loro rotte migratorie e di proiezione nel mesencefalo ventrale embrionale. Abbiamo scoperto che ci sono una serie di passaggi critici nel protocollo che dovrebbe essere attentamente curato in modo da ottenere fette che permettono il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale. La fase più critica è la dissezione del cervello embrio.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Martine Emond e Isabel Brachmann per il loro aiuto nello stabilire la organotipica sistema cultura fetta e Wolfgang Hübner e Liviu Gabriel Bodea per la lettura critica del manoscritto. Vorremmo ringraziare Frank Costantini per la R26 topi reporter e Tabin Cliff per i topi Creer Shh. Questo studio è stato finanziato da un premio di ricerca del Ministero della Scienza e della Ricerca del Nord-Reno Westfalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).
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Materiali
Tabella di reagenti e attrezzature specifiche
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Glucosio 30% | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| Siero di cavallo | Invitrogen | 26050-088 | |
| DMEM (4,5 g / L Glc., Con L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Penicillina / streptomicina 100x | Sigma-Aldrich | P4333-20 | |
| Acido L-ascorbico | Sigma-Aldrich | A4403 | preparare magazzino 200mm e conservare a -20 ° C |
| Ultrapura agarosio LMP | Invitrogen | 15517-022 | |
| Millicel inserti | Millipore | PICMORG50 | |
| μ-piatto 35 mm, a basso | Ibidi | 80136 | |
| Vibratome | Microm | HM 650V | |
| Lametta | Plano GmbH | 121-6 | |
| Histoacryl colla | BRAU9381104 | Braun Aesculap | |
| Spoon Dia perforata diametro 15 mm | Strumenti Scienza multa | 10370 -18 | |
| Pinza 5 Dumoxel | Strumenti Scienza multa | 11252-30 |
Anticorpi utilizzati per immunostainings:
| Nome dell'anticorpo | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Coniglio anti-tirosina idrossilasi | Millipore | AB152 | Diluizione 1:500 |
| Topo anti-tirosina idrossilasi | Millipore | MAB318 | Diluizione 1:500 |
| Topo anti-BrdU | BD Pharmingen | 555627 | Diluizione 1:200 |
| Coniglio anti-caspasi 3 spaccati | Tecnologia delle celle di segnalazione | 9661 | Diluizione 1:200 |
| Donkey anti-IgG di coniglio-Alexa 488 | Invitrogen | A21206 | Diluizione 1:500 |
| Donkey IgG anti-topo-Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | Diluizione 1:200 |
Riferimenti
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136-136 (2004).
- Martini, F. J.
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Ristampe e permessi
