Denne artikel skitserer en alsidig metode til at oprette celle-deriverede væv ringe af cellulære selvsamling. Glatte muskelceller seedet til ringformet agarose brønde samlet og kontrakt for at danne robuste tre-dimensionelle (3D) væv inden for 7 dage. Millimeter-skala væv ringe er befordrende for mekanisk afprøvning og tjene som byggesten for væv samling.
Hvert år hundredtusindvis af patienter, der gennemgår koronar arterie bypass operation i USA. 1 Omkring en tredjedel af disse patienter ikke har egnet autolog Donorfartøjer pga. sygdomsprogression eller foregående høst. Formålet med vaskulære tissue engineering er at udvikle en egnet alternativ kilde til disse bypass grafts. Desuden kan manipuleret karvæv vise sig værdifuld som levende vaskulære modeller til at studere hjerte-kar-sygdomme. Flere lovende tilgange til ingeniør blodkar er blevet udforsket, med mange nyere undersøgelser, der fokuserer på udvikling og analyse af celle-baserede metoder. 2-5 heri, vi præsenterer en metode til hurtigt at selv samle celler i 3D væv ringe, der kan bruges i vitro til model vaskulære væv.
For at gøre dette, er suspensioner af glatte muskelceller seeded i rundbundet ringformede agarose brønde. De ikke-klæbende egenskaber agarose giver the celler til at slå sig ned, samlede og kontrakt omkring en stilling i centrum af brønden for at danne et sammenhængende væv ring. 6,7 Disse ringe kan dyrkes i flere dage før høst for mekaniske, fysiologiske, biokemiske eller histologiske analyse. Vi har vist, at disse celle-deriverede væv ringe udbytte ved 100-500 kPa trækstyrke 8, der overstiger værdien rapporteret for andre manipuleret væv vaskulære konstruerer kulturperler for lignende varigheder (<30 kPa). 9,10 Vores resultater viser, at robuste celle -afledte karvæv ring generation kan nås inden for en kort tidsperiode, og giver mulighed for direkte og kvantitativ vurdering af bidrag fra celler og celle-afledte matrix (CDM) til at karvæv struktur og funktion.
For nylig har der været en øget interesse i celle-baserede eller "stillads-mindre" tissue engineering metoder til at løse nogle af de begrænsninger af stillads-baserede tissue engineering tilgange. I betragtning af, at celle-afledt væv er skabt af celler og matrix, de producerer, er de i sagens natur indeholder meget højere celle tætheder, indeholder ingen eksogene materialer, og kan laves helt fra humane celler og proteiner. Vaskulære vin lavet af menneskeceller kan opnå betydelig mekanisk styrke i mangel af eksogene stilladser (f.eks sprængtryk 3400 mmHg i forhold til 1600 mmHg for human saphenous vener) 12. Selvom cellebaserede karvæv udstille forbedret celletæthed og mekanisk styrke, de fleste nuværende fabrikation metoder (såsom "ark-baserede engineering" 3,4,12 eller "bioprinting" 5,13) kræve omfattende kultur perioder (> 3 måneder) eller specialudstyr til 3D væv byggeri. Den celle-afledte væv ring metoderod beskrevet her muliggør hurtig cellulær selvsamling at danne robuste 3D væv konstruerer inden for en kort periode og uden brug af specialudstyr.
Denne protokol beskriver den procedure, vi har udviklet til at skabe 2 mm indvendig diameter rotte glatte muskelceller afledt væv ringe. I det aktuelle eksempel var væv ringe dyrket i 7 dage (dengang kulturperler i yderligere 7 dage for ring fusion og rør dannelse). Men 2 mm rotte (og menneskelige) glatte muskelceller ringe kan fjernes fra brøndene og er sammenhængende nok til håndtering (fx overførsel til silikone rør) så tidligt som en dag efter celle såning. Derudover kan robust væv ringe med varierende indre diameter (2, 4 og 6 mm) være skabt med denne metode ved blot at ændre stillingen diameteren af den oprindelige polycarbonat formen. 8 Vi har også for nylig ændret polycarbonat design støbeforme, så fem 2 mm såning brønde til at blive kastet i en enkelt multi-godt agarose kammer, sombruger mindre PDMS og agarose, og passer i en brønd i en 6-brønds plade (data ikke vist). Ændringer i stillingen diameter, bredden af seeding godt, krumningsradius af afrundede bund, kan antallet af såning brønde, eller dybden af seeding brønde alle ændres blot ved at ændre specifikationerne i CAD-fil til CNC bearbejdning af polycarbonat mug. Endelig kan en enkelt polycarbonat støbeform bruges til at fremstille et ubegrænset antal PDMS skabeloner, og hver PDMS skabelon kan rengøres, autoklaveres og genbruges snesevis af gange.
Ud over at ændre størrelsen af vævet ringe, har vi lavet ringe fra mange forskellige celletyper, herunder: primær rotte SMCs (Cell Applications, R354-05), primære humane kranspulsåren SMCs (Lonza, CC-2583), primære humane dermale fibroblaster 11 (generøse gave af Dr. George Pins, WPI Afdeling for Biomedical Engineering), rotte lungefibroblaster (RFL-6, ATCC CCL-192), og mesenkymale stamceller (Lonza, PT-2501). Hver af disse celletyper aggregater og kontrakter omkring centrum indlæg til at danne væv ringe, selv om det cellulære organisation, ECM sammensætning, og mekaniske egenskaber konstruerer varierer for hver celle type. Det seeding parametre for hver celle type skal være empirisk afgøres baseret på størrelsen af celler og deres evne til at sammenlægge. Derfor, mens dette system for at skabe celle-afledte væv ringene er meget alsidig, kan protokollen behov små justeringer for optimal vævsdannelse med forskellige celletyper.
Tissue ring geometri gør det nemt at læsse og vurdering af vævsmateriale egenskaber ved enaksede trækprøvning, som beskrevet. Der er også betydelige præcedens for at bruge blodkar ring segmenter til at måle vaskulær kontraktion og fysiologiske funktion. Foreløbige undersøgelser tyder på, at celle-deriverede væv ringe kan monteres på en ledning myograph enhed til måling af farmakologiske lydhørhed ogkontraktile kraft generation (data ikke vist). Alt i alt, evnen til hurtigt at fabrikere selv-samlet celle ringe til histologiske, mekaniske, fysiologiske og biokemiske analyser tyder på et kraftfuldt nyt værktøj, der kan være nyttige til modellering karvæv struktur og funktion i sundhed og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) for hans hjælp med CNC bearbejdning. Desuden vil vi gerne takke Adriana Hera (WPI computer-og kommunikations center) for hendes hjælp med MATLAB programmering, samt Kate drikkevarer og Joseph Cotnoir (WPI Akademisk Technology Center) for at få hjælp med Camtasia. Sophie Burke og Jacleen Becker (WPI Akademisk Technology Center), forudsat supplerende video-optagelser. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (R15 HL097332), den UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (bachelor forskning stipendium til at JZH), og Worcester Polytechnic Institute (Summer Undergraduate Research Fellowship til JZH og institutionelle start-up midler til MWR).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalog # |
---|---|---|
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 |
Agarose | Lonza | 50000 |
DMEM | Mediatech | 15-017-CV |
Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA | A05-201 |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI |
Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 |
Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 |
Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |