Selektiv Viral transduktion af Voksen-fødte olfaktoriske neuroner for Kronisk In vivo Optogenetic Stimulation
Summary
Voksen-født neuroner i de olfaktoriske pære kan optogenetically styres med Channelrhodopsin2-udtrykkende lentiviral injektion i rostralt vandrende åen og kroniske photostimulation med en implanteret miniature LED.
Abstract
Lokale interneuroner løbende regenereres i lugtekolben af voksne gnavere 1-3. I denne proces, der kaldes voksen neurogenese, neurale stamceller i væggene af lateral ventrikel give anledning til neuroblasts at migrere til flere millimeter langs rostralt vandrende stream (RMS) til at nå og indarbejde de olfaktoriske pære. For at studere de forskellige trin og virkningen af voksen-fødte neuron integration i allerede eksisterende olfaktoriske kredsløb, er det nødvendigt at selektivt mærke og manipulere aktiviteten af dette specifikke population af neuroner. Den seneste udvikling af optogenetic teknologier giver mulighed for at bruge lys til at netop aktivere denne særlige gruppe af neuroner, uden at påvirke omkringliggende neuroner 4,5. Her præsenterer vi en række procedurer for at viralt udtrykke Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP i en tidsmæssigt begrænset kohorte af neuroblasts i RMS, inden de når frem til lugtekolben og blive voksen-fødte neurons. Derudover viser vi, hvordan man implantat og kalibrere en miniature LED for kronisk in vivo stimulering af ChR2-udtrykkende neuroner.
Protocol
Discussion
Optogenetic værktøjer har for nylig øget vores kontrol over selektiv neuronal befolkninger, herunder voksne født neuroner i de olfaktoriske system. Her beskriver vi, hvordan du udfører en stereotaxic injektion af en lentiviral vektor udtrykke ChR2-YFP i en bestemt population af voksne født neuroner. Ved nøje at overvåge den periode efter injektion, er vi i stand til at analysere og manipulere aktiviteten af en kohorte af voksen-født neuroner med en relativ homogen alder.
På g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af livsforsikringsselskabet "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurovidenskaber de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" inden for rammerne af "ERA-NET NEURON" af 7. rammeprogram, som Europa-Kommissionen, "Foundation pour la Recherche Medicale", den Letten Foundation og Pasteur Foundation.
Materials
| Material | Company | Catalogue No. |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompum 0.2% |
| Pipette Puller | Sutter | P-97 |
| Glass Capillaries (3.5″) | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fischer Elektronik | BL5.36Z |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 |
| Optical power meter | Thor Labs | PM100 |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC InternationalCorp. | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl |
Riferimenti
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 .
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
