Kraniofaciale brusk utvikles i nær kontakt med andre vev og er vanskelige å manipulere i levende dyr. Vi bruker electroporation å levere molekylære verktøy under vekst av kraniofaciale skjelettet mens omgåelsen tidlig embryoutvikling effekter. Denne tilnærmingen vil gi oss mulighet til å effektivt test kandidat molekyler<em> In vivo.</em
Electroporation er en effektiv metode for å levere DNA og andre belastes makromolekyler i vev ved presise tidspunkter og i presis steder. For eksempel har electroporation blitt brukt med stor suksess å studere nevrale og retinal utvikling i Xenopus, kylling og mus 1-10. Det er imidlertid viktig å merke seg at i alle disse studiene ble det etterforskerne ikke rettet mot myke vev. Fordi vi er interessert i kraniofaciale utvikling, tilpasset vi en metode for å målrette ansikts mesenchyme.
Da vi søkte litteraturen, fant vi til vår overraskelse, svært få rapporter om vellykket genoverføring inn cartilaginous vev. De fleste av disse studiene var genterapi studier, som siRNA eller protein levering i chondrogenic cellelinjer, eller dyremodeller av artritt 11-13. I andre systemer, for eksempel kylling eller mus, electroporation av ansikts mesenchyme har vært utfordrende (personlig communicationer, Dept of kraniofaciale Development, KCL). Vi hypotesen om at electroporation inn procartilaginous og cartilaginous vev i Xenopus kan fungere bedre. I våre studier, viser vi at genoverføring i ansikts cartilages skjer effektivt ved tidlige stadier (28), når ansikts primordium er fortsatt består av mykt vev før brusk differensiering.
Xenopus er en veldig tilgjengelig virveldyr system for analyse av kraniofaciale utvikling. Kraniofaciale strukturer er lettere synlig i Xenopus enn i noen andre virveldyr modell, først og fremst fordi Xenopus embryo er befruktet eksternt, slik at analyser av de tidligste stadiene, og tilrettelegge leve bildebehandling til enkelt celle oppløsning, samt gjenbruk av mødrene 14. Blant virveldyr modeller utvikle eksternt, er Xenopus mer nyttig for kraniofaciale analyse enn sebrafisk, som Xenopus larver er større og lettere å dissect, og utvikle ansikts-regionen er mer tilgjengelig for bildebehandling enn tilsvarende regionen i fisk. I tillegg er Xenopus evolusjonært nærmere mennesker enn sebrafisk (~ 100 millioner år nærmere) 15. Endelig på disse stadiene, Xenopus rumpetroll er gjennomsiktige, og samtidig uttrykk for fluorescerende proteiner eller molekyler vil tillate enkel visualisering av å utvikle brusk. Vi forventer at denne tilnærmingen vil gi oss mulighet til raskt og effektivt test kandidat molekyler i en in vivo modell system.
I denne videoen har vi demonstrert muligheten for electroporation-mediert genet levering i ansikts mesenchyme av Xenopus rumpetroll. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan vi omgå tidlige utviklingsskader av manipulere gen-funksjon som tillater oss å målrette bestemte vev ved senere tidspunkter. Våre studier viser at heterogene populasjoner av kraniofaciale mesenchymalceller kan påvirkes, slik at vi kan undersøke avstamning av electroporated celler samt cell autonome behov for proteiner av interesse. Kombinert med live bildebehandling, kan vi bruke denne tilnærmingen til å studere gen-funksjon, over tid, under kraniofaciale utvikling. Denne romanen Metoden fremhever tractability av Xenopus for studiet av organogenesen. Vi forventer at denne metoden kan grovt tilpasses studere morphogenesis og differensiering av andre vev i tillegg.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Nancy Papalopulu og Boyan Bonev for hjelp med Xenopus electroporation. Vi takker også Marc Dionne for kritisk lesing, Jeremy Green og John Wallingford for nyttige diskusjoner og medlemmer av Liu lab for deres støtte. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra BBSRC (BB/E013872/1) og Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) til KJL.