Электропорации черепно-лицевых Мезенхима

Summary

Черепно-лицевые хрящи развиваться в тесном контакте с другими тканями, и их трудно манипулировать живыми животными. Мы используем электропорации доставить молекулярных инструментов в процессе роста черепно-лицевой скелет в обход раннего эмбрионального эффектов. Такой подход позволит нам эффективно теста кандидат молекул<em> В естественных условиях.</em

Abstract

Электропорация это эффективный метод доставки ДНК и других заряженных макромолекул в тканях в точные моменты времени и в точных местах. Например, электропорации был с большим успехом используются для изучения нервных и сетчатки развития Xenopus, курицы и мыши ^1-10. Тем не менее, важно отметить, что во всех этих исследований, следователи не была направлена ​​на мягких тканях. Потому что мы заинтересованы в черепно-лицевой развития, мы адаптировали метод целевой лица мезенхимы.

Когда мы искали литературу, мы обнаружили, к нашему удивлению, очень мало сообщений о успешной передачи генов в хрящевой ткани. Большинство из этих исследований были генной терапии исследований, таких как миРНК или белка доставки в хондрогенного клеточные линии, или, животных моделях артрита ^11-13. В других системах, например, курицы или мыши, электропорации лица мезенхимы был сложным (личные КОММУНИКАЦИИионов, кафедра черепно-лицевых развития, KCL). Мы предположили, что электропорации в procartilaginous и хрящевой тканей в Xenopus могли бы работать лучше. В наших исследованиях показано, что перенос генов в лице хрящей эффективно происходит на ранних этапах (28), когда зачаток лица по-прежнему состоит из мягких тканей до хряща дифференциации.

Xenopus является очень доступным позвоночных система для анализа черепно-лицевой области развития. Черепно-лицевых структур более видимым в Xenopus, чем в любой другой модели позвоночных, прежде всего потому Xenopus эмбрионы оплодотворяются внешне, позволяя анализ ранних стадиях, а также содействие живых изображений на одной резолюции клетки, а также повторное использование матери ^14. Среди позвоночных моделей развивающихся внешне, Xenopus более полезно для черепно-лицевой анализа, чем данио рерио, а Xenopus личинки крупнее и легче диssect и развивающихся лицевой области является более доступным для визуализации, чем эквивалентные региона в рыбе. Кроме того, Xenopus является эволюционно ближе к людям, чем данио рерио (~ 100 млн лет ближе) ^15. Наконец, на этих этапах, Xenopus головастики прозрачны, и одновременно выражение флуоресцентных белков или молекул позволит легко визуализации развивающихся хрящей. Мы ожидаем, что такой подход позволит нам быстро и эффективно теста кандидат молекул в модели системы в естественных условиях.

Protocol

Часть 1A. Оборудование Микроскоп: вертикально стерео-рассекает область с низкой цель власти Напряжение / Импульсный Генератор: BTX ECM 830 квадратных системы Электропорация волна Внесите съемник: P-87 микропипетки Puller (Саттер Instrument Company, CA) Манипулятор: грубый, или в сочетании грубой и тонкой в зависимости от препарата. Микропипетки держателя: тонкие инструменты науки Электрод: домашнее Электропорация камеры: домашнее Г-образной формы электродов: Вырезать 8 см высокочистого 0,4 мм вольфрамовой проволоки (Гудфеллоу) и прикрепить на середину 1 мл шприц использованием шпаклевки (мы используем Blu-Tack). Оставьте 4 см вольфрамовой проволоки подвергаются от кончика шприца и согнуть наконечник в L-формы, 1 см от края (рис. 1А). Обрезать кончик так, чтобы конец мер 0,5 мм в длину. Тего кончик электрода конца. Запуск избыток параллельно вольфрамовой проволоки в шприц и использовать его для подключения генератора электрод импульса. Повторите процесс принятия пару электродов. Прикрепить электроды квадратных генератор пульсовой волны через кабель постоянного тока. Электропорация камеры Линия нижней части 90 мм блюдо с ~ 5 мм нетоксичного пластилина. Заполните блюдо с электропорации СМИ. Использование № 5 щипцы часовой вырезать Т-образные скважины (рис. 2). Долго и должны измерять ~ 2 мм х 2 мм х 10 мм и короткие ~ 2 мм х 2 мм х 5 мм. Электропорация блюдо можно мыть и использовать повторно. Часть 1В. Реагенты ДНК или заряженных макромолекул Микропипетки: 1 мм шириной 4 "долго боросиликатного стекла капилляров (WPI, TW100-F) Культура СМИ: Нормальный амфибия Media (NAM) > 10 X складе: 1100 мм NaCl, 20мМ KCl, 10 мМ Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 мМ ЭДТА. Автоклав и хранить при температуре 4 ° C. 1 X ДН: развести с 10x акции, буфер с 0,1 мМ NaHCO 3 и 0,2 мМ Na 3 PO 4. Xenopus laevis головастиков, этап 28 ДНК подготовки: Подготовка выражение плазмид с использованием стандартных протоколов. Ресуспендируют ДНК до конечной концентрации 1 мкг / мкл в нуклеазы свободного H 2 0. * Мы имели успех с векторов, содержащих сильный промотор CMV, таких как pCS2 + [16]. Для линии анализа, мы обычно включают ДНК, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP + pCS2) в конечной концентрации 0,1 мкг / мкл. [ДНК концентрации от 0,1-3 мкг / мкл были также проверены. Мы обнаружили, что концентрация ниже 0,8 мкг / мкл неэффективно меченых клеток, в то время как ДНК в концентрациях выше 2 мкг / м ищ л не улучшило эффективность электропорации]. Морфолино олигонуклеотидных подготовки: (Примечание:. МО должны быть fluoresceinated (3'-карбоксифлуоресцеина изменение) или иным образом взимается) Ресуспендируют морфолино олигонуклеотиды (МО) (Genetools, www.genetools.com ) в концентрации 2 мМ в нуклеазы свободного H 2 0. Тепло аликвоту маточного раствора при температуре 65 ° С в течение 5 минут. Развести до конечной концентрации 0,5 мМ в воде нуклеазы бесплатно. * 0,1-1мм МО решения были протестированы. 0,5 мМ МО решения было достаточно для электропорации многих мезенхимальных клеток. Микропипетки Подготовка микропипетки из боросиликатного стекла капилляров (1 мм в ширину, 4 "длинный, WPI нет. TW100-F). Используйте иглу съемник для подготовки микропипетки с 8-12 мм длиной конуса и тонкой наконечником. Давка наконечник ~ 2 ммот кончика использованием щипцов, создавая неровный разрыв. Средства массовой информации Инкубационный СМИ: Подготовьте свежий 3 / 4 Нормальная амфибия Media (ДН) от 1x акций. Добавить 0,025 мг / мл гентамицина. Электропорация СМИ: как указано выше, с 0,1% Benzocaine (Sigma, 06950). 2. Электропорация Микропипетки установки Заполните микропипетки с ~ 1 мкл раствора инъекций. Безопасные микропипетки в микроманипулятора и присоединить к microinjector (Picospritzer II). Угол микропипетки на 50 ° от столешницы. Установить давление впрыска при 20 PSI. Калибровка микропипетки вводить 30 п на импульс. Головастик подготовку Обезболить этапе 28 Xenopus личинок в стадии инкубационного периода электропорации СМИ в течение 5 минут. Передача под наркозом головастика в электропорации камере, наполненной электропорации СМИ. Позиция эмбрионав течение долгого хорошо так, чтобы голова упирается в Т-образном перекрестке с спинной стороной вниз и брюшной стороне подвергается. Голова должна быть слегка приподнята по сравнению с хвостом. Использование щипцов, мягко безопасный головастика в хорошо с окружающими пластилина. (Примечание:.. Если головастика не обеспечен, он может дергаться и контактных электродов во время электропорации В этом случае отказаться от головастика, как ткани лица будут серьезно повреждены) Электропорация Вставьте наконечник микропипетки сразу кзади от цемента и железа в лице мезенхимы. Inject 30 нл раствора в мезенхимы. Уберите микропипетки. Быстро выровнять электрода советы параллельно глава эмбриона (рис. 3). Применить 8 50 мс, 20 мВ прямоугольных импульсов. Уберите электродов. Использование щипцов тщательно релиз головастика из скважины и передача на 3 / 4 ДН, 0,025 мг / мл гентамицина. Головастики могут быть инкубировали в 3 / 4 ДН, 0,025 мг / мл overnIGHT, или дольше. Экран эмбрионов для эффективного электропорации помощью флуоресцентной микроскопии после 24 часов. 3. Представитель Результаты: Использование флуоресцентных молекул позволяет легко скрининг электропорации эмбрионов. На рисунке 4 показана типичная партия МО электропорации головастиков ~ 12, 48 и 96 часов после электропорации, инкубируют при 14,5 ° C. Использование флуоресцентной микроскопии, МО могут быть визуализированы сразу после электропорации и сохраняться в течение нескольких дней после электропорации. По нашему опыту, флуоресценции слабо заметен на стадии 46 (~ 5 дней позже). В хрящах, флуоресценция резко уменьшается после начала дифференциации (~ 42 м), однако, МО флуоресценции сохраняется сильнее, в другие типы клеток, такие как глоточной энтодермы. Флуоресцентная микроскопия показывает, что олигонуклеотиды были включены в несколько черепно-лицевых тканей, включая хрящ. Олигонуклеотидов флуоресценции сЧасто быть визуализированы в ткани по обе стороны головы. Это, вероятно, из-за быстрого распространения раствор для инъекций по всему свободные черепно-лицевой мезенхимы до электропорации. Рисунок 1 Домашнее электродов. Г-образной вольфрамовой проволоки прикрепляется к 1 мл шприц использованием нетоксичных глины или замазки. (А) электрода конечной меры 5 мм. (B) Прикрепите пару электродов, например, что концы идут параллельно. Электроды крепятся к импульсным генератором с помощью кабелей постоянного тока. Рисунок 2 Электропорация камеры. () 90 мм чашке выстроились с пластилином заполнена средствами массовой информации и Т-образной камеры резными щипцами № 5 часовщика. (B) длинной стороной меры 2 мм х 2 мм Х10 ммв то время как короткие меры 2 мм х 2 мм х 5 мм. Глава эмбриона лежит в Т-образном перекрестке, брюшной стороной вверх. Рисунок 3 Схема иллюстрирующая электропорации процедуры. Св. 28 головастик находится в электропорации камеры, вентральной стороной вверх. Микропипетки вставляется в лице мезенхимы основной железы цемента. Inject. Микропипетки удаляется, и Г-образные электроды расположены вдоль фланговые голову. Применить восемь 50 мс, 20 мВ прямоугольных импульсов. Уберите электродов. Расти головастиков желаемого этапа. Визуализируйте МО или GFP выражения с помощью флуоресцентной микроскопии. Рисунок 4 представителя головастиков 12 (А), 48 (Б) и 96 (С) часов после электропорации (стадии 30, 34 и 44 соответственно). ("-B") Флуоресцентные МО могут быть визуализированы в черепно-лицевой мезенхимы на оленях годов 30 и 34. Флуоресценции можно обнаружить в хрящах на стадии 44 (наконечник стрелы, С ^-С "). Кишка очень autofluorescent.

Discussion

В этом видео мы продемонстрировали возможности электропорации-опосредованной доставки генов в лице мезенхиме Xenopus головастиков. Используя этот подход, мы можем обойти на ранних стадиях развития последствия манипулирования функции гена позволяет нам ориентироваться на конкретные ткани в более поздние моменты времени. Наши исследования показывают, что гетерогенных популяций черепно-лицевой мезенхимальные клетки могут быть затронуты, что позволяет нам рассматривать линию электропорации клеток, а также автономные ячейки требования для белков, представляющих интерес. В сочетании с живой обработки изображений, мы можем использовать этот подход для изучения функций генов, с течением времени, в течение черепно-лицевой области развития. Этот новый метод подчеркивает уступчивость по Xenopus для изучения органогенеза. Мы ожидаем, что этот метод может быть широко адаптировано для изучения морфогенеза и дифференциации других тканей, а также.