Cristallizzazione high-throughput di proteine di membrana con il metodo lipidica Bicelle
Summary
Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile che mantengono proteine di membrana (MP) all'interno di un doppio strato lipidico, ma hanno un comportamento unico che facilita la fase di high-throughput screening da robot cristallizzazione. Questa tecnica ha prodotto con successo un certo numero di strutture ad alta risoluzione da entrambe le fonti procariote ed eucariote. Questo video descrive i protocolli per la generazione della miscela lipidica bicelle, incorporando i deputati nella miscela bicelle, la creazione di prove cristallizzazioni (manualmente così come robot) e cristalli raccolta dal mezzo.
Abstract
Proteine di membrana (MP) giocano un ruolo critico in molti processi fisiologici come il pompaggio di molecole specifiche attraverso il doppio strato di membrana impermeabile in caso contrario che circonda tutte le cellule e gli organelli. Alterazioni nella funzione del risultato parlamentari in molte malattie ei disturbi umani, quindi, una conoscenza intricata delle loro strutture rimane un obiettivo critico per la ricerca biologica. Tuttavia, la determinazione della struttura dei deputati rimane una sfida significativa spesso derivanti dalla loro idrofobicità.
Parlamentari hanno notevoli regioni idrofobiche incorporato all'interno del doppio strato. I detergenti sono spesso usati per solubilizzare queste proteine dal doppio strato generando una proteina-detergente micellare che possono poi essere manipolati in modo simile come proteine solubili. Tradizionalmente, i processi di cristallizzazione procedere con una proteina-detergente miscela, ma spesso resistono cristallizzazione o produrre cristalli di scarsa qualità. Questi problemi sorgono a causa dellaincapacità del detersivo per simulare adeguatamente il doppio strato con conseguente scarsa stabilità ed eterogeneità. Inoltre, gli scudi detergente sulla superficie idrofobica del MP riducendo la superficie disponibile per i contatti cristallo. Per aggirare questi inconvenienti i parlamentari possono essere cristallizzate nei media lipidico, che più da vicino simula l'ambiente endogeno, ed è recentemente diventata una tecnica de novo per la cristallizzazione MP.
Lipidico fase cubi (LCP) è un tridimensionale doppio strato lipidico penetrata da un sistema interconnesso di canali acquosi 1. Anche se monoolein è la scelta di lipidi, lipidi correlati come monopalmitolein e monovaccenin sono stati utilizzati anche per fare LCP 2. Parlamentari sono incorporati nella LCP dove si diffondono in tre dimensioni e cristallo nuclei feed. Un grande vantaggio del LCP è che la proteina rimane in un ambiente più nativo, ma il metodo ha una serie di inconvenienti tecnici compresi visc altaosity (che richiedono apparati specializzati) e le difficoltà nella visualizzazione di cristallo e la manipolazione 3,4. A causa di queste difficoltà tecniche, abbiamo utilizzato un altro mezzo lipidico per la cristallizzazione-bicelles 5,6 (Figura 1). Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile costituito dal taglio di un lipide fosfatidilcolina (DMPC) con un amphiphile (CHAPSO) o una catena corta lipidi (DHPC). All'interno di ogni disco bicelle, le molecole generano un doppio strato lipidico mentre la linea amphiphile molecole apolari che fornisce i bordi proprietà benefiche di entrambi doppi strati e detergenti. È importante sottolineare che, sotto la loro temperatura di transizione, proteine bicelle miscele hanno una viscosità ridotta e sono manipolati in modo simile come detergente-solubilizzato parlamentari, rendendo bicelles compatibile con i robot cristallizzazione.
Bicelles sono stati utilizzati con successo per cristallizzare proteine di membrana diverse 5,7-11 (Tabella 1). Questa raccolta in crescitadelle proteine dimostra la versatilità di bicelles per cristallizzare sia elicoidale alfa e beta parlamentari foglio da fonti procariote ed eucariote. A causa di questi successi e la semplicità di high-throughput attuazione, bicelles dovrebbero far parte dell'arsenale di ogni cristallografo proteina di membrana è. In questo video, si descrive la metodologia bicelle e fornire uno step-by-step del protocollo per la configurazione high-throughput prove di cristallizzazione purificata parlamentari utilizzando la robotica standard.
Protocol
Discussion
Bicelles sono un media unico lipidico che offrono un nativo doppio strato, come l'ambiente mentre si comportano come se solubilizzato da detergenti. Questa proprietà dà bicelles un netto vantaggio rispetto ad altre a base di lipidi metodi di cristallizzazione in quanto non vi è alcuna curva di apprendimento o di attrezzature specialistiche richieste per questa tecnica. Una volta bicelles sono disponibili, siano esse commerciali o preparati in laboratorio, possono essere miscelato direttamente con proteine p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Drs. James Bowie e Salem Faham per la fornitura di competenze tecniche e linee guida sul metodo bicelle e il Dr. Aviv Paz per le discussioni utili. Riconosciamo Le Du per il supporto sperimentale. Rachna Ujwal ha interessi finanziari in MemX Biosciences LLC, che, tuttavia, non ha supportato questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
Riferimenti
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