Uncoating è un passo essenziale nella fase iniziale del ciclo di vita di HIV-1 ed è definito come lo smontaggio del guscio capside e il rilascio del complesso ribonucleoproteina virale (vRNP). In questo studio dimostriamo tecniche per isolare nuclei intatti da HIV-1 virioni e per quantificare la loro uncoating In vitro.
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Articolo metodologico
In uncoating vitro di HIV-1 Cores
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il genoma dei retrovirus è racchiuso in un capside circondato da un involucro lipidico. Per i lentivirus, come l'HIV-1, la conchiglia conica capside è composto di proteine CA disposti come un reticolo di esagono. Il capside è chiuso da 7 pentameri alla fine ampio e 5 alla parte più stretta del cono 1, 2. Racchiuso in questa shell capside è il complesso ribonucleoproteina virale, e insieme costituiscono il nucleo.
In seguito alla fusione della membrana virale con la membrana della cellula bersaglio, di HIV-1 è rilasciata nel citoplasma. Il capside poi smonta il rilascio gratuito CA in forma solubile 3 in un processo denominato uncoating. La posizione intracellulare e la tempistica di HIV-1 uncoating sono poco conosciuti. Singolo aminoacido sostituzioni in CA che alterano la stabilità del capside anche compromettere la capacità del virus HIV-1 di infettare le cellule 4. Ciò indica che la stabilità del capside è fondamentale per HIV-1. HIV-1 uncoating è stata difficile da studiare a causa della mancanza di disponibilità di test sensibile e affidabile per questo processo. Qui si descrive un metodo quantitativo per lo studio in vitro utilizzando uncoating nuclei isolati da infezioni HIV-1 particelle. L'approccio prevede l'isolamento dei nuclei per sedimentazione di virioni concentrati attraverso uno strato di detergente e in un gradiente di saccarosio lineare, al freddo. Per quantificare uncoating, i nuclei isolati sono incubati a 37 ° C per diversi intervalli di tempo e poi pellet da ultracentrifugazione. Il grado di uncoating è analizzato da quantificare la frazione di CA nel surnatante. Questo approccio è stato impiegato per analizzare gli effetti delle mutazioni virale HIV-1 la stabilità del capside 4, 5, 6. Dovrebbe anche essere utile per studiare il ruolo dei fattori cellulari di HIV-1 uncoating.
Protocollo
1. La produzione di HIV-1 particelle
Prima di procedere, è necessario ottenere l'autorizzazione e seguire le indicazioni dall'ufficio biosicurezza del tuo istituto di lavorare in un impianto di biosicurezza approvato per infettivo. È necessario assicurarsi che cura e precauzioni di sicurezza sono seguite durante la lavorazione nel laboratorio di biosicurezza.
La produzione di HIV-1 particelle è di solito eseguita da trasfezione transiente di cellule 293T con HIV-1 DNA provirale utilizzando un metodo di fosfato di calcio transfezione 7, 8. Alta riserve di virus titolo cresciuto da colture di cellule T ....
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Discussione
Il metodo qui descritto per purificare l'HIV-1 core per studiare uncoating in vitro è utile per lo studio di questa fase del ciclo di HIV-1 vita, soprattutto a causa di indisponibilità di un metodo convalidato di analisi uncoating HIV-1 nelle cellule bersaglio. Anche se questo metodo utilizza ultracentrifugazione equilibrio per purificare core, altri ricercatori hanno utilizzato pellettizzazione diretta dopo breve lisi con 1% Triton X-100-12, 13 o cubettatura attraverso un cuscino di saccarosio sovrappost.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
HIV-1 uncoating studi in laboratorio Aiken sono stati sostenuti da sovvenzioni NIH AI40364, AI50423 e AI076121. Diversi materiali chiave, tra cui i reagenti utilizzati nel p24 ELISA, sono state fornite dal NIH AIDS programma di ricerca e di riferimento, Divisione di AIDS, NIAID, NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0,25% tripsina-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composizione: 50 mM BES [p H 6,95], 280 mM NaCl e 1,5 mM Na 2 HPO 4. Portare il pH a 6,95a temperatura ambiente. Filtro sterilizzare e conservare in aliquote a -20 ° C. | ||
| Rivestimento di anticorpi: anticorpi monoclonali per p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS programma di ricerca e reagente di riferimento | 3537 | |
| Anticorpi primari: l'HIV-Ig (iperimmuni siero del paziente umano) | NIH AIDS Research Programma di riferimento e dei reagenti | 3957 | |
Anticorpo secondario: Capra anti-IgG umane, coniugati con perossidasi | Perforare | 31130 | |
| HRP substrato | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB Piastre a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti e SW32.1 rotori Ti e ultracentrifuga compatibile | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotore e ultracentrifuga da tavolo | Beckman Coulter | ||
| Alta velocità di provette per microcentrifuga | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi di frazionamento di un gradiente di densità di flusso | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradiente Ex | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
Riferimenti
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature.
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Ristampe e permessi
