In vitro Uncoating av HIV-1 kärnor
Summary
Uncoating är ett viktigt steg i den tidiga fasen av HIV-1 livscykel och definieras som demonteringen av kapsid skalet och frisläppandet av den virala ribonucleoprotein komplexa (vRNP). Här visar vi tekniker för att isolera intakta kärnor från HIV-1 virioner och för att kvantifiera deras uncoating<em> In vitro</em>.
Abstract
Genomet av retrovirus är inkapslad i en kapsid omgiven av en lipid kuvert. För lentiviruses, såsom HIV-1, är den koniska kapsid skalet består av CA protein arrangeras som ett galler för Hexagon. Den kapsid stängs av 7 pentamers på den breda änden och 5 i den smala änden av konen 1, 2. Innesluten i denna kapsid skalet är virala ribonucleoprotein komplexa, och tillsammans utgör kärnan.
Efter fusion av virala membran med målet cellmembranet, är HIV-1 släpps ut i cytoplasman. Kapsid sedan demonteras släppa fri CA i löslig form 3 i en process som kallas uncoating. Den intracellulära plats och tidpunkt för HIV-1 uncoating är dåligt kända. Enstaka aminosyror substitutioner i Kalifornien som förändrar stabiliteten i kapsid försämrar också förmågan av HIV-1 för att infektera celler 4. Detta tyder på att stabiliteten i kapsid är avgörande för HIV-1 infektion. </p>
HIV-1 uncoating har varit svårt att studera på grund av bristande tillgång på känsliga och tillförlitliga testmetoder för denna process. Här beskriver vi en kvantitativ metod för att studera uncoating in vitro med hjälp av borrkärnor isolerad från smittsam HIV-1 partiklar. Den strategi som innebär isolering av kärnor genom sedimentation av koncentrerad virioner genom ett lager av tvättmedel och till en linjär sackaros gradient, i kylan. Att kvantifiera uncoating, är isolerade kärnor inkuberas vid 37 ° C för olika tidsintervall och därefter pelleterat genom ultracentrifugering. Omfattningen av uncoating analyseras genom att kvantifiera hur stor del av CA i supernatanten. Denna metod har använts för att analysera effekter av viral mutationer i HIV-1 kapsid stabilitet 4, 5, 6. Det bör också vara användbart för att studera betydelsen av cellulära faktorer i HIV-1 uncoating.
Protocol
Discussion
Den metod som beskrivs här för att rena HIV-1-kärnor för att studera uncoating in vitro är användbar för att studera denna fas av hiv-1 livscykel, särskilt på grund av avsaknad av en validerad metod för att analysera HIV-1 uncoating i målceller. Även om denna metod använder jämvikt ultracentrifugering att rena kärnor, andra har använt direkt pelletering efter kort lys med 1% Triton-X-100 12, 13 eller pelletering genom sackaros kudde täckt med 0,1% Triton-X-100 14, 15.
<p class=…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV-1 uncoating studier i Aiken laboratoriet fick stöd av NIH bidrag AI40364, AI50423 och AI076121. Flera viktiga material, inklusive reagens som används i p24 ELISA, lämnades av NIH aids forsknings-och referensbibliotek Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
Riferimenti
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. . Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
