Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster</em

Summary

Variation phénotypique des traits peut résulter de mutations dans le cis-régulation élément (CRE) des séquences que les modèles de contrôle l'expression des gènes. Méthodes pour une utilisation dérivée de Drosophila melanogaster peuvent comparer quantitativement les niveaux de la répartition spatiale et temporelle de l'expression génique médiée par des variantes de la CRE modifiés ou naturelle.

Abstract

Profils d'expression génique sont spécifiées par l'élément cis-régulatrices (CRE) des séquences, qui sont aussi appelés rehausseurs ou cis-régulation des modules. Un classique de la CRE possède un arrangement de sites de liaison pour plusieurs protéines facteur de transcription qui confèrent une logique réglementaire précisant quand, où et à quel niveau le gène réglementé (s) est exprimée. L'ensemble complet des CRE au sein d'un génome animal encode le programme de l'organisme pour le développement ¹ et empiriques ainsi que des études théoriques indiquent que des mutations dans CRE a joué un rôle prépondérant dans l'évolution morphologique ^2-4. Par ailleurs, le génome humain études d'association indiquent que la variation génétique à Cres contribuer sensiblement à la variation phénotypique ^5,6. Ainsi, la compréhension logique de la réglementation et la façon dont les mutations affectent telle logique est un objectif central de la génétique.

Transgènes Reporter fournir une méthode puissante pour étudier la fonction in vivotion de Cres. Voici une séquence connue ou suspectée CRE est couplé à promoteur hétérologue et des séquences codant pour un gène rapporteur codant pour une protéine facilement observables. Quand un transgène rapporteur est inséré dans un organisme hôte, l'activité de la CRE devient visible sous la forme de la protéine rapporteur codée. Transgénèse médié par la P-élément dans l'espèce de mouche drosophile (D.) melanogaster ⁷ a été utilisé pendant des décennies pour introduire des transgènes rapporteur dans cet organisme modèle, bien que le placement en génomique des transgènes est aléatoire. Ainsi, l'activité du gène rapporteur est fortement influencée par la chromatine des gènes et l'environnement locaux, limitant les comparaisons qualitatives CRE pour être. Ces dernières années, le système d'intégration basé PhiC31 a été adapté pour une utilisation chez D. melanogaster pour insérer des transgènes dans spécifiques ^{de 80 à 10} sites de débarquement du génome. Cette capacité a fait de la mesure quantitative des gènes et, pertinent ici, la CRE d'activité ^11-13 Feasible. La production de mouches des fruits transgéniques peuvent être externalisées, notamment PhiC31 intégration basée, éliminant le besoin d'acheter du matériel coûteux et / ou avez une maîtrise spécialisée dans l'injection des protocoles transgène.

Ici, nous présentons un protocole général d'évaluer quantitativement une activité de la CRE, et de montrer comment cette approche peut être utilisée pour mesurer les effets d'une mutation introduite sur l'activité de la CRE une et de comparer les activités des CRE orthologues. Bien que les exemples donnés sont pour une activité de la CRE pendant la métamorphose mouche des fruits, l'approche peut être appliquée à d'autres stades de développement, les espèces de mouches des fruits, ou des organismes modèles. Finalement, une utilisation plus généralisée de cette approche de la CRE d'étude devrait faire progresser la compréhension de la logique réglementaire et comment la logique peut varier et évoluer.

Protocol

Vue d'ensemble: Cette vidéo montre un protocole capable de mesurer quantitativement les activités de régulation génique pour le cis-régulatrices élément (CRE) des séquences de la drosophile (D.) melanogaster. Ce protocole peut être utilisé pour comparer les activités de réglementation possédé par: type sauvage et mutant formes CRE, naturelle allèles CRE trouve au sein d'une espèce ou entre espèces CRE orthologues divergé. 1. Spécifi…

Discussion

éléments cis-régulateurs coder le programme génomique qui spécifie l'expression des gènes et donc le processus de développement ^1, et sont des endroits bien visibles pour les deux mutations sous-jacentes évolution morphologique ^2-4 et variation phénotypique des traits humains ^5,6,19. En dépit de cette importance, la logique réglementaire pour CRE restent mal compris. Une raison importante de ce déficit a été la compréhension de l'absence de méthodes appro…