Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Summary

Daha kısa DNA moleküllerinin mekanik özelliklerini incelemek için sabit bir kuvvet eksensel optik cımbız kullanımını göstermektedir. Eksenel DNA germe, biz bize ~ 100 nm gibi kısa DNA molekülleri çalışmaya izin sterik engel ve konvansiyonel yanal manipülasyon doğan eserler minimize.

Abstract

Az kilobaz daha kontur uzunluklarda DNA germe için Tek molekül tekniklerin deneysel güçlüklerle doludur. Bununla birlikte, bu gibi histon ve DNA bağlayıcı ^{protein, 1,2-aracılı} döngü olarak çok ilginç biyolojik etkinlikleri, bu uzunluk ölçek üzerinde meydana gelir. Son yıllarda, DNA mekanik özelliklerini kompakt nükleozom ve kromatin ipliklerinin ^3,4 içine DNA paketleme gibi temel hücresel süreçler önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Açıkçası, DNA'nın kısa menziller mekanik özelliklerini anlamak için o önemlidir. Bu yazıda, biz birkaç yüz basepairs gibi kısa kontur uzunluktaki DNA'nın mekanik davranışlarını incelemek için geliştirmiş olduğumuz tek-molekül optik tweezing tekniği için pratik bir kılavuz sağlamak.

DNA'nın kısa segmentlerinde gerilmelerde büyük engel, geleneksel optik cımbız genellikle directio kuvvet uygulamak için tasarlanmış olann, aşama ^{5,6 yanal,} (bakınız Şek. 1). Bu geometri olarak, boncuk ve lamel arasındaki açı olan DNA gergin olduğu, mikron uzunlukta DNA için çok dik hale gelir. Eksenel pozisyonunu artık uzatma yakın lamel mikroküre sürükler yana, sterik etkiler geliştirilmiştir, bir meydan okuma olabilir, sorumluydu, ve olmalıdır. Buna ek olarak, mikro asimetri bir sonucu olarak, yan uzantılar oluşturur uzantı boyunca reaktif güç yönü değişirse beri optik tuzak içinde nedeniyle mikrosfer dönme momenti, değişen.

Germe Mikronaltı DNA için alternatif yöntemlerin kendilerine özgü engellerin karşı çalıştırın. Örneğin, bir çift-kiriş optik tuzak hangi iki tuzak arasında ve mikroküreler arasında ışık saçılması ikinci nokta parazit etkileri önemli bir sorun teşkil başlar, bir dalga boyu yaklaşık DNA germe ile sınırlıdır. Tuzakları biri DeğiştirilmesiBir mikropipet ile büyük olasılıkla benzer sorunlar muzdarip olacaktır. Biri doğrudan DNA germek için eksenel potansiyel kullanabilirsiniz iken, aktif bir geribildirim düzeni sabit bir kuvvet ve bu bant genişliği özellikle düşük güçlerine, oldukça sınırlı olacaktır uygulamak için gerekli olacaktır.

Biz doğrudan sabit bir kuvvet eksenel optik cımbız ^7,8 kullanarak lamel uzak DNA çekerek bu temel sorunları aşmak. Bu, optik gücü sabit güç olan lazer gücü ayarlamak suretiyle ayarlanabilir olan optik potansiyel bir doğrusal bölgesinde, boncuk yakalama ile elde edilir. Doğrusal bölgede bindirme ayrıca eksenel yönde yaklaşık 350 nm boyunca uzanan DNA üzerinde bir bütün optik güç kelepçe olarak hizmet vermektedir. Lamel yapışmış bir referans mikroküre, aynı konumda ve odak kalır, böylece Biz aynı anda ince sahne konumunu ayarlayarak termal ve mekanik sürüklenme telafi birneredeyse sınırsız gözlem dönemi için llowing.

Protocol

1. Cımbızlar Kurulumu Bir 1064 nm lazer ışını iki ortogonal polarize ışınları ayrılmıştır. Bir başka (bakınız Şek. 2) kalibrasyon amacıyla kullanılan en biyomolekül işlemek için kullanılır. Her bir kiriş pozisyon ve odak bağımsız olarak, sırasıyla, ışın yönlendirme aynası ve optik teleskoplar ile kontrol edilir manipülasyon ışın yoğunluğu, bir akusto-optik deflektör (ATH) tarafından kontrol edilir. Kirişler sonra başka bir polarize ışın ayı…

Discussion

Konvansiyonel optik cımbız bir refraktil nesne üzerinde sabit bir kuvvet uygulamak için analog ya da bilgisayar kontrollü geribildirim güvenmek. Bu aktif geri besleme sistemleri, bir protein bağlama gelen DNA ya da bir filaman boyunca bir moleküler motorun hızlı bir atlama için, örneğin, zorluk numune bir uzantısı olarak ani değişiklikler meydana koşullar altında icra var. Sabit kuvvetlerinin uygulanması için çeşitli pasif yöntemler son zamanlarda geliştirilmiştir. Basepair çözünürlükte RN…

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific

Supplementary Materials

A. Hydrodynamic Friction Coefficient

For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion^5,10:

where the following shorthand has been introduced:

The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere’s center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.

B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration

The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.

C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model

The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:

where F_opt is the optical force, x_o is a fit parameter for the zero force extension,x_opt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*_p is a second fit parameter for an “effective” persistence length. F_wlc is given by the usual WLC model¹¹

where ε is the relative DNA extension.