Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET
Summary
FRET basée sur les journalistes sont de plus en plus utilisées pour suivre les activités kinases et de phosphatases dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici une méthode sur la façon d'utiliser FRET basé journalistes afin d'évaluer le cycle cellulaire dépendante des changements dans la phosphorylation cible.
Abstract
Förster résonance de transfert d'énergie (FRET) basé sur une reporters permettre l'évaluation de la kinase endogène et activités phosphatase dans des cellules vivantes. Ces sondes sont généralement constitués de variantes du CFP et YFP, est intervenu par une séquence phosphorylable et un domaine phospho-contraignant. Après phosphorylation, la conformation sonde change, ce qui entraîne un changement de la distance ou l'orientation entre le CFP et YFP, conduisant à un changement dans l'efficacité de FRET (Fig 1). Plusieurs sondes ont été publiés durant la dernière décennie, la surveillance de l'équilibre d'activité des kinases et phosphatases multiples, y compris les journalistes de la PKA 2, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 et 9 PLK1 . Compte tenu de la conception modulaire, les sondes supplémentaires sont susceptibles d'émerger dans le proche avenir 10.
La progression dans le cycle cellulaire est affectée par le stress signaling voies 11. Notamment, le cycle cellulaire est régulée différemment pendant imperturbable croissance par rapport à quand les cellules se remettent du stress 12. Imagerie time-lapse de cellules dans le cycle cellulaire nécessite donc des précautions particulières. Cela devient un problème particulier lors de l'utilisation d'imagerie ratiométrique, puisque deux images avec un signal élevé par rapport au bruit sont nécessaires pour interpréter correctement les résultats. Ratiométrique FRET imagerie des modifications du cycle cellulaire dépendante des activités kinase et phosphatase a essentiellement été limité à des sous-sections du cycle cellulaire 8,9,13,14.
Ici, nous discutons d'une méthode pour surveiller FRET basée sur des sondes à l'aide d'imagerie ratiométrique au long du cycle cellulaire humain. La méthode repose sur l'équipement qui est disponible pour de nombreux chercheurs en sciences de la vie et ne nécessite pas de connaissances d'experts de la microscopie ou de traitement d'image.
Protocol
Discussion
Surveillance de FRET au long du cycle cellulaire nécessite des considérations qui sont moins cruciales lors de l'évaluation à court terme des réponses à des stimuli externes. Tout d'abord, la progression du cycle cellulaire est facilement perturbée par la signalisation du stress, exigeant que la phototoxicité est maintenu à un minimum. Deuxièmement, tous les journalistes peuvent potentiellement affecter les processus cellulaires en titrant sur les kinases, les phosphatases ou des domaines d'interac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont soutenus par le Conseil de recherche suédois, la Fondation suédoise pour la recherche stratégique, la société du cancer suédois, la société suédoise de l'enfant le cancer, Wibergs Åke fondation et Jeanssons fondation.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
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