निगरानी सेल चक्र के माध्यम से ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट क्रियाएँ
Summary
झल्लाहट – आधारित संवाददाताओं तेजी से जीवित कोशिकाओं में kinase और फॉस्फेट गतिविधियों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जाता है. यहाँ हम कैसे झल्लाहट – आधारित संवाददाताओं का उपयोग करने के लिए लक्ष्य की phosphorylation में सेल चक्र निर्भर परिवर्तन का आकलन पर एक विधि का वर्णन.
Abstract
Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा (झल्लाहट) स्थानांतरण आधारित संवाददाताओं 1 जीवित कोशिकाओं में अंतर्जात kinase और फॉस्फेट गतिविधियों के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं. इस तरह की जांच आमतौर पर CFP और YFP के वेरिएंट, एक phosphorylatable अनुक्रम और एक phospho बाध्यकारी डोमेन द्वारा हस्तक्षेप से मिलकर बनता है. Phosphorylation पर, जांच परिवर्तन रचना, या CFP और YFP के बीच दूरी उन्मुखीकरण के एक परिवर्तन में जो परिणाम में एक परिवर्तन के लिए अग्रणी दक्षता झल्लाहट (चित्र 1). कई जांच पिछले दशक के दौरान प्रकाशित किया गया है, कई kinases और phosphatases की गतिविधि संतुलन PKA 2, PKB 3, 4, PKC PKD 5, 6 ERK, JNK 7, 18 CDK अरोड़ा 9 बी के संवाददाताओं और Plk1 9 सहित निगरानी . मॉड्यूलर डिजाइन को देखते हुए अतिरिक्त जांच के लिए निकट भविष्य में 10 उभरने की संभावना हैं.
कोशिका चक्र के माध्यम से प्रगति signali तनाव से प्रभावित हैएनजी रास्ते 11. विशेष रूप से, कोशिका चक्र जब कोशिकाओं को तनाव से 12 उबर रहे हैं तुलना में वृद्धि से बेफिक्र दौरान अलग नियंत्रित किया जाता है समय चूक कोशिका चक्र के माध्यम से कोशिकाओं की इमेजिंग इसलिए विशेष सावधानी की आवश्यकता है.. यह एक समस्या बन जाता है विशेष रूप से जब ratiometric इमेजिंग रोजगार, के बाद से शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत के साथ दो छवियों को सही ढंग से परिणामों की व्याख्या करने के लिए आवश्यक हैं. Ratiometric झल्लाहट kinase और फॉस्फेट गतिविधियों में सेल चक्र निर्भर परिवर्तन के इमेजिंग predominately सेल चक्र 8,9,13,14 के उप वर्गों के लिए प्रतिबंधित किया गया है है.
यहाँ, हम एक विधि झल्लाहट – आधारित मानव कोशिका चक्र के दौरान ratiometric इमेजिंग का उपयोग कर जांच की निगरानी पर चर्चा की. विधि उपकरण है कि जीवन विज्ञान में कई शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध है और माइक्रोस्कोपी या छवि प्रसंस्करण के विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता नहीं है पर निर्भर करता है.
Protocol
Discussion
मॉनिटरिंग सेल चक्र के दौरान झल्लाहट विचार है कि कम महत्वपूर्ण हैं जब बाह्य stimuli करने के लिए अल्पकालिक प्रतिक्रियाओं का आकलन की आवश्यकता है. सबसे पहले, कोशिका चक्र प्रगति को आसानी से तनाव संकेतन द्वारा प…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक स्वीडिश अनुसंधान परिषद, सामरिक अनुसंधान, स्वीडिश कैंसर समाज, स्वीडिश बच्चे कैंसर समाज, AKE Wibergs नींव और Jeanssons नींव के लिए स्वीडिश नींव द्वारा समर्थित हैं.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
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