안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링
Summary
안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.
Abstract
포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 기반 기자 1 살아있는 세포의 내생 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동의 평가를 허용합니다. 이러한 프로브는 일반적으로 phosphorylatable 시퀀스와 phospho – 바인딩 도메인 방해 CFP 및 YFP의 변종의 구성됩니다. 인산화되면 변화로 이어지는 CFP와 YFP 사이의 거리 또는 방향의 변경 결과 프로브 변경 형태는 (그림 1) 효율성을 무서워. 몇몇 프로브는 PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, ERK 6, JNK 7, CDK 18, 오로라 B 9 기자와 Plk1 구 등의 여러 kinases와 phosphatases의 활동 균형을, 모니터링, 지난 10 동안 공개되었습니다 . 모듈형 설계 감안할 때, 추가 프로브는 향후 10 등장할 가능성이있다.
세포주기를 통해 진행은 스트레스 signali에 의해 영향을받습니다NG 11 경로. 특히, 세포주기는 세포가 스트레스를 12 회복하는 경우에 비해 성장을 교란되지 않은 동안 다르게 규제입니다. 세포주기를 통해 세포의 시간 경과 이미징 따라서 특별한주의가 필요합니다. ratiometric 이미징을 채용 특히 잡음 비율 높은 신호를 두 개의 이미지가 정확하게 결과를 해석하는 데 필요한 때문에 이것은 문제가된다. Ratiometric는 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동에 세포주기에 의존 변경 이미징이 predominately 세포주기 8,9,13,14의 하위 섹션에 제한되었습니다 무서워.
여기, 우리는 인간의 세포주기에 걸쳐 ratiometric 이미징을 사용하여 걱정 기반 프로브를 모니터링하는 방법을 논의합니다. 방법은 생명 과학의 많은 연구자에게 제공하고 현미경이나 영상 처리의 전문 지식을 필요로하지 않는 장비에 의존합니다.
Protocol
Discussion
세포주기에 걸쳐 무서워 모니터링하는 것은 외부 자극에 단기 반응을 평가했을 때 덜 중요한 고려 사항이 필요합니다. 첫째, 세포주기의 진행은 쉽게 phototoxicity이 최소로 보관이 필요한, 스트레스 신호에 의해 불안정하게된다 는걸 알수 있습니다. 둘째, 모든 기자 잠재적 kinases, phosphatases 또는 상호 작용 도메인을 titrating으로 세포 프로세스에 영향을 줄 수 있습니다. 실험 조건이 충분한 경우…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 스웨덴 연구 협의회, 전략 연구, 스웨덴의 암 사회, 스웨덴의 아동 암 사회 아케 Wibergs 재단과 Jeanssons 기초에 대한 스웨덴의 기초에 의해 지원됩니다.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
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