Atividades de monitoramento quinases e fosfatases através do ciclo celular por raciométrica FRET
Summary
FRET baseado jornalistas estão cada vez mais utilizados para monitorar atividades quinase e fosfatase em células vivas. Aqui nós descrevemos um método de como usar FRET baseado jornalistas para avaliar o ciclo de dependentes de células alterações na fosforilação alvo.
Abstract
Förster transferência de energia por ressonância (FRET) baseado em uma repórteres permitir a avaliação da quinase endógena e atividades da fosfatase em células vivas. Sondas tais tipicamente consistem de variantes do PCP e YFP, interveio por uma seqüência fosforilável e um domínio fosfo-binding. Após a fosforilação, a sonda conformação mudanças, o que resulta em uma mudança da distância ou da orientação entre PCP e YFP, levando a uma mudança na eficiência FRET (Fig. 1). Sondas de vários trabalhos foram publicados na última década, o monitoramento do equilíbrio atividade de quinases e fosfatases múltiplas, incluindo repórteres de PKA 2, PKB 3, PKC 4, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, Aurora B 9 e 9 Plk1 . Dado o design modular, sondas adicionais é provável que surjam no futuro próximo 10.
Progressão do ciclo celular é afetada pelo estresse signaling caminhos 11. Notavelmente, o ciclo celular é regulado de forma diferente durante imperturbável crescimento em relação a quando as células estão se recuperando do estresse 12. Time-lapse de imagens de células através do ciclo celular, portanto, requer um cuidado especial. Isso se torna um problema particularmente quando se emprega imagens raciométrica, uma vez que duas imagens com uma alta relação sinal-ruído são obrigados a interpretar corretamente os resultados. Raciométrica FRET imagem das mudanças do ciclo celular dependentes em atividades quinase e fosfatase tem sido predominantemente restrita ao sub-seções do ciclo celular 8,9,13,14.
Aqui, discutimos um método para monitorar FRET baseado em sondas utilizando imagens raciométrica todo o ciclo celular humano. O método baseia-se em equipamento que está disponível para muitos pesquisadores em ciências da vida e não requer conhecimento especializado de microscopia ou processamento de imagem.
Protocol
Discussion
Monitoramento FRET todo o ciclo celular requer considerações que são menos cruciais na avaliação de curto prazo respostas a estímulos externos. Primeiro, a progressão do ciclo celular é facilmente perturbado por sinalização stress, exigindo que fototoxicidade é reduzido ao mínimo. Segundo, todos os repórteres podem afetar os processos celulares pela titulação fora quinases, fosfatases ou domínios de interação. A maneira provavelmente mais simples de avaliar se as condições experimentais são adequado…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são apoiados pelo Conselho de Pesquisa sueco, a fundação sueca para pesquisas estratégicas, a sociedade de câncer sueco, a sociedade do câncer sueco criança, Wibergs Åke fundação e fundamento Jeanssons.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
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