Мониторинг киназы и фосфатазы деятельности путем клеточного цикла Логометрический FRET
Summary
FRET основе репортеры все чаще используются для контроля киназы и фосфатазы деятельность в живых клетках. Здесь мы опишем метод, как использовать FRET основе журналистам для оценки клеточного цикла зависит от изменений в целевую фосфорилирования.
Abstract
Ферстер резонанс переноса энергии (FRET)-основанной журналистам 1 позволяют оценка эндогенной киназы и фосфатазы деятельность в живых клетках. Такие зонды обычно состоят из вариантов CFP и YFP, вмешался phosphorylatable последовательности и фосфорно-связывающий домен. После фосфорилирования, конформации зонд изменения, что приводит к изменению расстояния или ориентации между CFP и YFP, что приводит к изменению FRET эффективности (рис. 1). Несколько зондов были опубликованы в течение последнего десятилетия, мониторинг активности баланс нескольких киназ и фосфатаз, в том числе журналисты ПКА 2, ПКБ 3, РКС 4, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, Cdk 18, Aurora B 9 и 9 Plk1 . С учетом модульной конструкции, дополнительными зондами, будут возникать и в ближайшем будущем 10.
Прогрессия через клеточный цикл влияет стресс signaliнг пути 11. Примечательно, что клеточный цикл регулируется по-разному в невозмущенной рост по сравнению с когда клетки восстанавливается после стресса 12. Покадровый изображений клеток через клеточный цикл, следовательно, требует особой осторожности. Это становится проблемой, особенно при использовании логометрических изображений, так как два изображения с высоким отношением сигнал-шум должны правильно интерпретировать результаты. Логометрический FRET изображений клеточного цикла зависимые изменения в киназы и фосфатазы деятельность имеет преимущественно ограничивалась подразделы клеточного цикла 8,9,13,14.
Здесь мы рассмотрим метод мониторинга FRET основе использования зондов логометрических изображения по всему человеческому клеточного цикла. Метод основан на оборудование, которое доступно для многих исследователей в области биологических наук и не требует специальных знаний микроскопии или обработки изображений.
Protocol
Discussion
Мониторинг FRET протяжении клеточного цикла требует соображения, которые являются менее важно при оценке краткосрочных ответов на внешние раздражители. Во-первых, прогрессию клеточного цикла легко возмущенного стресс сигнализации, требуя, чтобы фототоксичности сведено к минимуму. Во-?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы при поддержке Шведского исследовательского совета, Шведский фонд стратегических исследований, шведское общество рака, шведском обществе раком ребенка, Оке Wibergs фундамент и Jeanssons фундамент.
Materials
| Reagent | Catalogue Number | Company |
| Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
| DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
| 0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
| Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
| DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
| Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |
Riferimenti
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, 716-721 (2006).
- Kunkel, M. T., Ni, Q., Tsien, R. Y., Zhang, J., Newton, A. C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. J. Biol. Chem. 280, (2005).
- Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C. J. Cell. Biol. 161, 899-909 (2003).
- Kunkel, M. T., Toker, A., Tsien, R. Y., Newton, A. C. Calcium-dependent regulation of protein kinase D revealed by a genetically encoded kinase activity reporter. Journal of Biological Chemistry. 282, 6733-6742 (2007).
- Harvey, C. D. A genetically encoded fluorescent sensor of ERK activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19264-19269 (2008).
- Fosbrink, M., Aye-Han, N. N., Cheong, R., Levchenko, A., Zhang, J. Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5459-5464 (2010).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis. Dev. Cell. 18, 533-543 (2010).
- Fuller, B. G. Midzone activation of aurora B in anaphase produces an intracellular phosphorylation gradient. Nature. 453, 1132-1136 (2008).
- Ni, Q., Titov, D. V., Zhang, J. Analyzing protein kinase dynamics in living cells with FRET reporters. Methods. 40, 279-286 .
- Morgan, D. O. . The cell cycle : principles of control. , (2007).
- Lindqvist, A., Rodriguez-Bravo, V., Medema, R. H. The decision to enter mitosis: feedback and redundancy in the mitotic entry network. J. Cell. Biol. 185, 193-202 (2009).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J. Cell. Biol. 189, 247-259 (2010).
- Macurek, L. Polo-like kinase-1 is activated by aurora A to promote checkpoint recovery. Nature. 455, 119-123 (2008).
- van der Eb, A. J., Graham, F. L. Assay of transforming activity of tumor virus DNA. Methods. Enzymol. 65, 826-839 (1980).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. Biotechniques. 42, 71-75 (2007).
- Roszik, J., Lisboa, D., Szollosi, J., Vereb, G. Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry–approaches and a software solution. Cytometry A. 75, 761-767 (2009).
