FRET basada en los periodistas están cada vez más utilizado para monitorear las actividades de quinasa y fosfatasa en las células vivas. Aquí se describe un método sobre el uso de FRET basada en la prensa para evaluar el ciclo celular dependiente de los cambios en la fosforilación de destino.
Förster transferencia de energía por resonancia (FRET) basado en una prensa permite la evaluación de la quinasa endógena y las actividades de la fosfatasa en las células vivas. Estas sondas consisten normalmente en las variantes de la PPC y YFP, intervenido por una secuencia phosphorylatable y un dominio de unión a fosfato. Tras la fosforilación, la conformación de la sonda cambios, que se traduce en un cambio de la distancia y orientación entre la PPC y YFP, dando lugar a un cambio en la eficiencia de FRET (Figura 1). Varias sondas han sido publicados en la última década, el seguimiento del balance de la actividad de múltiples quinasas y fosfatasas, incluyendo reporteros de la PKA 2, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, Cdk 18, Aurora B 9 y Plk1 9 . Dada la estructura modular, sondas adicionales es probable que surjan en el futuro cerca de 10.
Progresión del ciclo celular se ve afectada por el estrés signaling vías 11. Cabe destacar que el ciclo celular está regulado de manera diferente durante imperturbable crecimiento en comparación con cuando las células se están recuperando del estrés 12. Time-lapse de imágenes de células a través del ciclo celular por lo que requiere especial precaución. Esto se convierte en un problema particularmente cuando se emplean imágenes radiométrica, ya que dos imágenes con una elevada relación señal ruido están obligados a interpretar correctamente los resultados. Radiométrica de imágenes de FRET los cambios dependiente del ciclo celular en las actividades de quinasa y fosfatasa ha sido predominantemente restringida a sub-secciones del ciclo celular 8,9,13,14.
En este caso, hablamos de un método para supervisar FRET basado en sondas utilizando imágenes radiométrica todo el ciclo de la célula humana. El método se basa en un equipo que está disponible para muchos investigadores en ciencias de la vida y no requiere conocimientos técnicos de la microscopía y procesamiento de imágenes.
Monitoreo FRET todo el ciclo celular requiere de consideraciones que son menos importantes cuando se evalúa a corto plazo respuestas a los estímulos externos. En primer lugar, progresión del ciclo celular es fácilmente perturbada por las señales de estrés, lo que requiere que la fototoxicidad se mantiene al mínimo. En segundo lugar, todos los periodistas pueden afectar los procesos celulares en la titulación de quinasas, fosfatasas o dominios de la interacción. La forma en que probablemente más sencilla de eva…
The authors have nothing to disclose.
Los autores se apoyan en la investigación sueca del Consejo, la fundación sueca para la investigación estratégica, la Sociedad Sueca del Cáncer, la sociedad del cáncer infantil sueco, Ake Wibergs y la Fundación Jeanssons.
Reagent | Catalogue Number | Company |
Leibovitz L-15, no phenol red | 21083-027 | GIBCO, by Life Technologies |
DMEM+Glutamax-I | 31966 | GIBCO, by Life Technologies |
Fetal Bovine Serum (FBS) | SV30160.03 | HyClone |
0.05% Trypsin EDTA | SH30236.01 | HyClone |
Penicillin-Streptomycin | SV30010 | HyClone |
DPBS | 14287 | GIBCO, by Life Technologies |
Puromycin | P8833 | Sigma-Aldrich |