Summary
لمتابعة تطور استجابة مناعية أكثر من مرة داخل الماوس نفسه، ويمكن إزالة الغدد الليمفاوية بشكل متتابع عن طريق الجراحة. هنا، نحن تصف كيف يمكن تنفيذ هذه التقنية.
Abstract
في مجال علم المناعة، لفهم تطور استجابة مناعية ضد لقاح لعدوى أو ورم، ويتبع في كثير من الأحيان استجابة مع مرور الوقت. وبالمثل، فإن دراسة التوازن لمفاوية يتطلب بطبيعة الحال التجارب المرة. تنفيذ هذه الدراسات في الماوس نفسه مثالية للحد من التقلبات التجريبية، فضلا عن عدد من الفئران المستخدمة. سحب الدم يسمح أداء التجارب مسار الزمن، لكنه يعطي فقط معلومات حول تعميم الخلايا اللمفية، ويقدم لعدد محدود من الخلايا 1-4. منذ الخلايا الليمفاوية من خلال تعميم الجسد والمقيمين في الغدد الليمفاوية لها خصائص مختلفة، من المهم أن تدرس كلا الموقعين. إزالة متتابعة من الغدد الليمفاوية عن طريق الجراحة يوفر فرصة فريدة لمتابعة استجابة مناعية أو توسيع الخلية المناعية في الماوس نفسه مع مرور الوقت. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب ينتج بين الخلايا 6 1-2x10 في العقدة الليمفاوية التي هي كافية لPErform التوصيف المظهري و / أو فحوصات وظيفية. وقد متتابعة لعملية جراحية العقدة الليمفاوية أو الغدد الليمفاوية استخدمت بنجاح من قبلنا وغيرها من 5-11. هنا، نحن تصف كيف يمكن إزالة العقد اللمفية العضدية، والاربية من خلال جعل شق صغير في الجلد من فأر anesthetised. منذ العملية الجراحية هو سطحي والقيام بسرعة، والماوس للشفاء بسرعة كبيرة، ويشفى تماما وليس تجربة الألم المفرط. كل يوم الثاني على التوالي، فمن الممكن لجني الغدد الليمفاوية واحد أو اثنين مما يسمح للتجارب دوام. هذا الأسلوب هو مناسب وبالتالي إلى دراسة خصائص العقدة الليمفاوية، الخلايا الليمفاوية المقيمين على مر الزمن. هذا النهج هو مناسبة لتصاميم تجريبية مختلفة، ونعتقد أن العديد من المختبرات ستستفيد من تنفيذ عمليات جراحية متتابعة العقدة الليمفاوية.
Protocol
1. إعداد قبل الجراحة
عولجت فئران وفقا لمبادئ توجيهية المجلس الكندي للرعاية الحيوان.
- Anesthetise الفئران عن طريق الحقن من الكيتامين / زيلازين (150/300 ملغ / كلغ، والملكية الفكرية) أو عن طريق استنشاق isoflurane (2٪، والأكسجين 1L). إذا كانت متوفرة، يجب استخدام isoflurane لأنها تسمح لتحسين السيطرة على الوقت التخدير وعمق. أيضا، ويدير الأكسجين في نفس الوقت الذي تدعم الوظائف الفسيولوجية للحيوان. وعلاوة على ذلك، يتم التخلص مباشرة isoflurane بواسطة الرئتين، وبالتالي لا يتطلب عملية التمثيل الغذائي كبدي أو كلوي.
- حقن البوبرينورفين (0،05 حتي 0،1 مغ / كغ، SC) أو مسكن آخر.
- تطبيق مرهم للعين فأر قبل الجراحة لتجنب جفاف العين (إذا تم استخدام isoflurane).
- تحقق من أن الفأر هو نائم بواسطة معسر مخلب والمتداول ذيله. إذا الماوس لا يتفاعل، المضي قدما في عملية جراحية.
2. في جراحة
الطبقة = "jove_content"> ومن الممكن إزالة 4 من العقد اللمفاوية السطحية (LN) عن طريق الجراحة: في الاربية (2) والعضدية 2. عزلة LN أسهل في الفئران العجاف الشباب (6-8 أسابيع) منذ وجود الأنسجة الدهنية في الفئران الأكبر سنا يمكن أن تتداخل مع العزلة LN. ومع ذلك، يتم التغلب على هذا القيد مع الممارسة المتكررة. لراحة الفئران، ونحن حصاد بحد أقصى 2 LNS في وقت واحد، وعندما نقوم الوقت طبعا التجارب، ونحن حصاد LNS كل يوم الثاني على التوالي. أيضا، للوقاية من العدوى، يمكن إعطاء المضادات الحيوية لفأر، ولكن لم نفعل ذلك والجروح وشفاء ما يرام. يحتاج المرء أن يكون على علم بأن اعتمادا على التصميم التجريبي، واستخدام المضادات الحيوية يمكن أن تؤثر في النتيجة لاحظ (على سبيل المثال إذا تم قياس استجابة لنوع من البكتيريا). لاحظ أن يتم تعقيم كل الأدوات بعد كل استخدام، وجرى الابقاء على ظروف معقمة طوال الإجراءات.
- وضع الماوس على جانبها.
- توطين في المنطقة حيث سيتم إجراء incisioن، اعتمادا على LN تريد الحصاد. (الشكل 1).
- تطبق الكلورهيكسيدين، أو مطهر آخر، إلى تلك المنطقة.
- جعل شق صغير مع مقص حاد (حوالي 5 ملم) إما على الجزء الخلفي من الرجل الاماميه أو فوق مخلب هند بالقرب من البطن (الشكل 1).
- إزالة الشعر فضفاض كنت قد قطع مع الملقط. إذا كنت تفضل ذلك، قد حلق الماوس قبل إجراء شق. ومع ذلك، فإنه يطيل الداخلي ونجد أنه ليس من الضروري منذ ذلك الحين، كما هو موضح هنا، فإنه لا يحسن الشفاء أو نقصان العدوى، والتي هي نادرة جدا على حد سواء.
- تمتد شق مع 2 ملقط من أجل رؤية LN. قد شق تصل الى 10 ملم. ويظهر LN رمادي أو أغمق من الدهون المحيطة بها.
- قرصة فآسيا (الغشاء الرقيق الذي يغطي الدهون والأنسجة) على رأس LN مع واحد ملقط وسحب خفيفة من دون كسر الأنسجة المحيطة.
- ضع ملقط 2 إلى أقصى حد ممكن underneath في LN. مع ملقط الأولى، كسر اللفافة وإزالة LN. إذا كنت قد نجحت في حصد LN، وينبغي أن وصمة عار من الدم تظهر في الموقع حيث كانت تقع في السابق LN. نلاحظ أن المصارف LN في حل متساوي التوتر. هذا اختبار بسيط يسمح لك للتحقق من صحة التي تم استخراجها 1 LN والأنسجة وليس الدهون.
- تحقق من عدم وجود الشعر في الجرح.
- إغلاق شق طريق الالتزام الأجزاء 2 من الجلد معا (داخل البشرة)، وتدبيس لهم مقطع. نستخدم بعض كليب ميشال مع ملقط تطبيق. تثبيت واحد أو 2 لقطات اعتمادا على حجم من شق. في معظم الأحيان، لقطات تسقط عندما النسيج يشفي.
3. بعد العملية الجراحية العناية
- إضافة بعض المواد الغذائية الرطبة في الجزء السفلي من القفص وبالتالي فإن الفئران يمكن أن تغذي بسهولة بعد الجراحة.
- حوالي 6 إلى 8 ساعات بعد الجراحة، والتحقق من الفئران للتأكد من أنها لا تواجه الألم. مراقبة بعناية سلوكهم (الموقف، مشية، فيteraction مع متجانس ومظهر من الفراء). إذا كان المظهر العام للفئران والفقراء، وإدارة جرعة ثانية من البوبرينورفين. في اليوم التالي يجب أن الفئران استعادة سلوكهم الطبيعي وإلا الاستمرار في إدارة البوبرينورفين. وينبغي أن الفئران لم تصل إلى النهاية التي سبق تحديدها وقبولها من قبل مجلس رعاية الحيوان الخاصة بك. قد ترغب في الحصول على المشورة والمساعدة من جهاز فني رعاية الحيوان المربى اليابس.
4. العقدة اللمفية المناولة
- في المختبر، للحصول على تعليق خلية واحدة، وفصل LN وفقا للإجراءات المعتادة. نضغط LN ضد الشرائح متجمد والحصول بصورة روتينية 1-2 × 10 6 خلية لكل LN. بدلا من ذلك، ونحن نستعد للLN لاستخراج الحمض النووي الريبي.
- وصمة عار على الخلايا وفقا للبروتوكول الخاص المعتاد. يجب عليك الحصول المتوقع ملامح الخلوي LN تدفق.
5. ممثل النتائج
مثال ص مبعثر إلى الأمام والجانبويظهر الكثير من أجل LNS تحصد من الماوس تخدير عن طريق الجراحة أو من الماوس ضحى (الشكل 2). في لمحة والنسب المئوية للخلايا اللمفاوية في بوابة الحية هي نفسها مما يدل على أن LN جراحة هو أسلوب ملائم للخلايا الحصاد.
الشكل 1. الأربي والعضدية توطين LN في الماوس. يقع أ LN الأربية فقط فوق مخلب هند، قليلا نحو البطن. ب. يقع LN العضدية وراء الرجل الاماميه.
الرقم التدفق الخلوي 2. الملف من الخلايا الليمفاوية التي تم الحصول عليها بعد عملية جراحية LN. وتظهر ملامح مبعثر إلى الأمام والجانب لLNS تحصد من anesthetized الماوس عن طريق الجراحة (A) أو من الماوس ضحى (B). كانت تحصد LNS، فصلها وتحليلها على تدفق عداد الكريات. ويبين النسب المئوية للخلايا اللمفاوية في بوابة الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت نحن بروتوكولا للجراحة LN التي يمكن أن تنطبق على كثير من النظم التجريبية. وعلى الرغم من المفيد جدا لمتابعة الاستجابات المناعية أو المناعي توازن الخلية، هذه التقنية لديها عدد قليل من القيود. أولا، يمكن أن يحصد سوى أربعة LNS. ثانيا، يجب أن يكون رد الفعل المناعي دراسة منهجية أو تحدث في LNS سطحي (البشرة استنزاف) الأربية أو العضدية. أخيرا، ويتأثر عدد الخلايا التي تحصد من نوعية إزالة LN، وتحديد التقنية التي قد تساهم في تقلب التجريبية عندما تكون هناك حاجة أرقام الخلية المطلق. ومع ذلك، فإن النسبة المئوية للخلايا المستهدفة، من تلقاء نفسه، يمكن أن توفر معلومات دقيقة وذات صلة خاصة عندما حجم LN لا تختلف باختلاف ظروف تجريبية مختلفة. لحسن الحظ، مرة واحدة ويتقن جيدا هذه التقنية، ونوعية إزالة LN يحسن، والسماح لأعداد الخلايا استنساخه للغاية في كل LN. ونحن نعتقد أنه على الرغم من هذه القيود القليلة، LN جراحة يوفر المزايا الرئيسية للدراسةتطور الاستجابات المناعية. أولا، يمكن تتبع الاستجابة المناعية على مر الزمن في ماوس معين، وخفض التباين التجريبية، فضلا عن عدد من الفئران المستخدمة. الثانية، يمكن أن أحداث مثل توازن الخلايا اللمفاوية أو استجابة مناعية بدء التي تحدث في LNS درس مباشرة. آخر ميزة كبيرة هي التي يمكن استعادتها أكثر من خلايا الدم من LNS من السماح لتوصيف خلية ممتدة. هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لأغراض أخرى مثل التنميط الجيني أو دراسة الفئران المعدلة وراثيا من السكان المقيمين خلية أخرى أو الاتجار بها من خلال LNS مثل الخلايا البائية، والخلايا الجذعية الضامة.
وقد تم مختبرنا وغيرها باستخدام هذه التقنية لعدة سنوات ونحن لم يلاحظ أي تدخل في سياق الاستجابة المناعية 7-9،12،13 وعلى توازن المناعة 5-7. لم متتابعة لعملية جراحية في LN يستريح من النوع البري C57BL / 6 الفئران لا يؤثر على نسبة وعدد CD4 + + الخلايا التائية 5-7. وعلاوة على ذلك، كما لم يؤثر على هذه المعلمات في LNS المتبقية. وعلاوة على ذلك، خلال رد فعل مناعي، لم سطحي إزالة LN لا يؤثر على حركية للاستجابة الخلايا التائية ولا جيل من الخلايا التائية الذاكرة 8،9،12،13. وعلاوة على ذلك، ثم جنبا إلى جنب مقارنة من استجابة الخلايا التائية إما عن طريق عملية جراحية LN متتابعة أو التضحية الماوس لم تظهر أي اختلافات في أيدينا (نتائج غير منشورة، والشكل 2). ولذلك، متتابعة جراحة LN هو مناسبة لدراسة التوازن تي خلية والاستجابة لها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر سيلفي ليسيج وجميع أفراد مختبر لقراءة نقدية للبروتوكول. وأيد هذا العمل من خلال منحة (MOP-77545) من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR). ويدعم ناتالي Labrecque بواسطة منحة دراسية كبار FRSQ وميليسا ماتيو تلقى الكسندر غراهام بيل NSERC منحة دراسات عليا كندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
