שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D
Summary
פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר תאים<em> In vivo / לשעבר vivo</em> באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד, על מנת לחקור galvanotaxis / electrotaxis ותגובות סלולריים אחרים לכוון הנוכחי (DC) שדות חשמליים (EPS).
Abstract
שדות חשמליים אנדוגני (EPS) להתרחש באופן טבעי in vivo ו לשחק תפקיד קריטי במהלך התפתחות רקמות / איברים והתחדשות, כולל זה של 1,2 מערכת העצבים המרכזית. EFS אנדוגניים אלו מופקים על ידי רגולציה הסלולר התחבורה יונית בשילוב עם ההתנגדות החשמלית של תאים ורקמות. זה כבר דווח כי אפלייד EF הטיפול יכול לקדם תיקון התפקודי של פגיעות בעמוד השדרה אצל בעלי חיים ובני אדם 3,4. בפרט, EF מכוונת נדידת תאים הודגמה במגוון רחב של סוגי תאים 5,6, כולל ובתאים עצביים (NPCs) 7,8. יישום ישיר (DC) EFS הנוכחי אינו טכניקה זמין בדרך כלל ברוב המעבדות. תיארנו פרוטוקולים מפורטים עבור היישום של EFS DC ל תאים בתרביות רקמה בעבר 5,11. כאן אנו מציגים הפגנה וידאו של שיטות סטנדרטיות מבוסס על כוח שדה מחושב להקים 2Dד סביבות 3D עבור NPCs, ולחקור התגובות הסלולר לגירוי EF בצמיחה בשני תנאים בודדים תא 2 ד, ו פרוסה organotypic חוט השדרה ב-3D. Cordslice השדרה הוא רקמה הנמען האידיאלי ללימוד NPC לשעבר ב vivo התנהגויות, לאחר השתלה, כי הארגון רקמות cytoarchitectonic נשמר גם בתוך התרבויות הללו 9,10. בנוסף, מודל זה vivo לשעבר גם מאפשר הליכים כי הם לא ריאלי מבחינה טכנית לעקוב אחר תאים in vivo באמצעות זמן לשגות הקלטה ברמת תא בודד. חשוב באופן קריטי על מנת להעריך התנהגויות סלולריים בסביבה לא רק 2D, אלא גם במצב organotypic 3D אשר mimicks בסביבה vivo. מערכת זו תאפשר ברזולוציה גבוהה הדמיה באמצעות זכוכית המבוססים על מאכלים כיסוי ברקמות או איברים עם התרבות מעקב 3D של נדידת תאים אחת במבחנה לשעבר vivo והוא יכול להיות שלב ביניים לפני שעבר אל ב vivo פרדיגמות.
Protocol
Discussion
הפרוטוקולים בהם אנו משתמשים מתבססים על מחקרים קודמים 5,11. התנאים הנוכחיים באמצעות שיטות אלה, תרבות יציבה חשמלי יכול להישמר תוך יישום EF באמצעות גשרים אגר, הפתרון של שטיינברג, ו Ag / AgCl, אלקטרודות לתאי או פרוסות בתרבית תאים electrotactic אישית מעוצבת של ממדים סטנדרטיים ומ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי החברה המלכותית URF מענק UF051616, בריטניה המועצה האירופית למחקר STG מענק 243,261 ל BS. עבודה ב MZ המעבדה נתמך גם על ידי המכון לרפואה של קליפורניה הרגנרציה מענק RB1-01417.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | B.D. Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | Gibco | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Riferimenti
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
