Dit manuscript beschrijft drie aanvullende protocollen voor de beoordeling van de toxiciteit van polyglutamine (polyQ)-uitbreiding van eiwitten in de gist<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast om de toxiciteit van andere verkeerd gevouwen eiwitten in gist te controleren.
Eiwit misfolding gaat gepaard met veel ziekten, in het bijzonder neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en Huntington 1. Ziekte van Huntington (HD) wordt veroorzaakt door de abnormale groei van een polyglutamine (polyQ) regio van het eiwit huntingtin. De polyQ-uitgebreide huntingtine eiwit bereikt een afwijkende conformatie (dat wil zeggen dat misfolds) en veroorzaakt cellulaire toxiciteit 2. Minstens acht andere neurodegeneratieve ziekten worden veroorzaakt door polyQ-uitbreidingen, waaronder de spinocerebellaire ataxieën en Kennedy de ziekte van 3.
Het modelorganisme gist heeft vergemakkelijkt belangrijke inzichten in de cellulaire en moleculaire basis van polyQ-toxiciteit, met inbegrip van het effect van de intra-en inter-moleculaire factoren van polyQ-toxiciteit, en de identificatie van cellulaire mechanismen die worden geremd in cellen die polyQ-expansie eiwitten 3-8. Belangrijkly, werden vele aspecten van polyQ-toxiciteit die werden gevonden in gist gereproduceerd in andere experimentele systemen en tot op zekere hoogte in monsters van HD-patiënten, waaruit blijkt het belang van het gist-model voor de ontdekking van fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen polyQ-toxiciteit.
Een directe en relatief eenvoudige manier om polyQ-toxiciteit te bepalen in gist is het meten van groeistoornissen van de gist-cellen die polyQ-expansie eiwitten. Dit manuscript beschrijft drie complementaire experimentele benaderingen van polyQ-toxiciteit vast te stellen in gist door het meten van de groei van gist-cellen die polyQ-expansie eiwitten. De eerste twee experimentele benaderingen volgen gistgroei op de borden, de derde benadering houdt toezicht op de groei van de vloeibare gist culturen met behulp van de BioscreenC instrument.
Bovendien, dit manuscript beschrijft experimentele moeilijkheden die zich kunnen voordoen bij het hanteren van gist polyQ modellen en schetst de strategieën die zullen helpen om of te vermijdenminimaliseren van deze problemen. De hier beschreven protocollen kunnen worden gebruikt om vast te stellen en genetische routes en kleine moleculen die polyQ toxiciteit moduleren karakteriseren. Bovendien kan de beschreven assays als sjablonen voor nauwkeurige analyse van de toxiciteit die door andere ziekte-gerelateerde gevouwen eiwitten in gist modellen.
Dit manuscript beschrijft drie complementaire experimentele benaderingen van polyQ-toxiciteit te meten in het modelorganisme gist op basis van verminderde groei van de gist-cellen die giftige polyQ-expansie eiwitten. Werk in gist heeft aangeboden diepgaande inzichten in de fundamentele cellulaire en moleculaire mechanismen van eiwitten verkeerd vouwen en de daaruit voortvloeiende toxiciteit, met inbegrip van het verkeerd vouwen en de toxiciteit van polyQ-expansie eiwitten 9,11,12. Experimenten op basis van de…
The authors have nothing to disclose.
Werk in de Duennwald laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de Amerikaanse Federatie voor Aging Research (Afar), de erfelijke ziekte Foundation (HDF) en de William Wood Foundation.
Name of instrument | Company | Catalogue number |
Frogger (6×8 pins) | V&P Scientific, San Diego | VP 407 AH |
BioscreenC | Growthcurves USA | 5101370 |
100-well Honeycomb plates | Growthcurves USA | 9602550 |