כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים בשמרים<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. פרוטוקולים אלה יכולים בקלות להיות שונה כדי לפקח על רעילות של חלבונים misfolded אחרים שמרים.
Abstract
Misfolding חלבון קשורה עם מחלות אנושיות רבות, במיוחד מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון 1. מחלת הנטינגטון (HD) נגרמת על ידי התרחבות חריגה של האזור polyglutamine (polyQ) בתוך huntingtin חלבון. חלבון polyQ-מורחבת huntingtin משיגה קונפורמציה סוטה (כלומר misfolds) וגורם רעילות הסלולר 2. לפחות שמונה מחלות ניווניות נוספות נגרמות על ידי polyQ למוצרי הרחבות, כולל Ataxias Spinocerebellar ומחלת קנדי 3.
שמרים אורגניזם מודל יש להקל תובנות משמעותיות על בסיס תאית ומולקולרית של רעילות-polyQ, כולל ההשפעה של הגורמים התוך והבין המולקולרי של polyQ-רעילות, וכן זיהוי של מסלולים תאיים כי לקויי בתאים לבטא polyQ-הרחבה חלבונים 3-8. חשובלי, היבטים רבים של רעילות-polyQ שנמצאו השמרים היו לשכפל מערכות ניסיוניות אחרות ובמידה מסוימת בדגימות מחולים HD, ובכך מפגין את המשמעות של המודל שמרים על גילוי מנגנונים בסיסיים בבסיס polyQ-רעילות.
בדרך ישירה ופשוטה יחסית כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים היא למדוד פגמים הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. כתב יד זה מתאר שלוש גישות משלימות הניסוי כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים על ידי מדידת הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. הראשון שתי גישות ניסיוניות לעקוב אחר הצמיחה השמרים על צלחות, הגישה 3 מנטרת את הצמיחה של תרבויות שמרים נוזליים באמצעות מכשיר BioscreenC.
יתר על כן, כתב היד הזה מתאר קשיים ניסויים שיכולים להתרחש בעת טיפול polyQ מודלים שמרים מתאר אסטרטגיות שיעזרו למנוע אולמזער את הקשיים הללו. פרוטוקולים המתוארים כאן יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין מסלולים גנטיים ומולקולות קטנות לווסת polyQ-רעילות. יתר על כן, מבחני המתוארים יכולים לשמש תבניות עבור ניתוחים מדויקים של רעילות הנגרמת על ידי מחלה הקשורים חלבונים אחרים misfolded במודלים של שמרים.
Protocol
1. ביטוי PolyQ-הרחבה חלבונים רעילים שמרים ניתוח שיטתי הקימה את רצף חומצות האמינו המדויק של חלבון polyQ-הרחבת שנדרש כדי לייצר רעילות בשמרים 7. זה חלבון רעיל polyQ-הרחבה מכילה אמינו מסוף הדגל תג ואחריו 17 חומצות האמינו הרצף המקורי של חלב…
Discussion
כתב יד זה מתאר שלוש גישות ניסיוניות משלימות כדי למדוד polyQ-רעילות בשמרים אורגניזם מודל המבוסס על צמיחה מופחתת של תאים שמרים המבטאים רעילים polyQ-הרחבה חלבונים. עבודה שמרים הציעה תובנות עמוקות לתוך המנגנונים תאית ומולקולרית הבסיסיים של misfolding חלבון ו רעילות שהתפתח שלה, כ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדה Duennwald נתמך על ידי תרומות של הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות (מרחוק), קרן מחלה תורשתית (HDF) ואת עץ ויליאם קרן.