Questo manoscritto descrive tre protocolli complementari per valutare la tossicità di poliglutamina (polyQ)-espansione proteine nel lievito<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Questi protocolli possono essere facilmente modificati per controllare la tossicità di altre proteine mal ripiegate in lievito.
Misfolding è associato con molte malattie umane, in particolare malattie neurodegenerative, quali morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattia di Huntington e 1. Malattia di Huntington (HD) è causata dall'espansione anormale di uno (polyQ) all'interno della regione poliglutammina huntingtina proteina. Il polyQ-espansa proteina huntingtina raggiunge una conformazione aberrante (cioè misfolds) e provoca tossicità cellulare 2. Almeno altri otto malattie neurodegenerative sono causate da polyQ di espansioni, compresa la spinocerebellare Atassie e la malattia di Kennedy 3.
Il lievito organismo modello ha facilitato intuizioni significative nella base cellulare e molecolare di polyQ-tossicità, incluso l'impatto dei fattori intra-ed inter-molecolari di polyQ-tossicità, e l'individuazione di percorsi cellulari che sono in pericolo in cellule che esprimono polyQ espansione proteine 3-8. Importantely, molti aspetti della polyQ-tossicità che sono stati trovati nel lievito sono state riprodotte in altri sistemi sperimentali e in qualche misura nei campioni provenienti da pazienti HD, dimostrando così l'importanza del modello di lievito per la scoperta dei meccanismi di base che sottendono polyQ-tossicità.
Un modo diretto e relativamente semplice per determinare polyQ-tossicità in lievito è misurare difetti di crescita di cellule di lievito che esprimono proteine polyQ-espansione. Questo manoscritto descrive tre approcci complementari sperimentale per determinare polyQ-tossicità in lievito misurando la crescita di cellule di lievito che esprimono proteine polyQ-espansione. I primi due approcci sperimentali monitorare la crescita del lievito sui piatti, il terzo approccio controlla la crescita di colture di lievito liquido utilizzando lo strumento BioscreenC.
Inoltre, questo manoscritto descrive le difficoltà sperimentali che possono verificarsi durante la manipolazione modelli polyQ lievito e delinea le strategie che vi aiuteranno a evitare oridurre al minimo queste difficoltà. I protocolli descritti qui possono essere utilizzate per identificare e caratterizzare percorsi genetici e piccole molecole che modulano polyQ-tossicità. Inoltre, i saggi descritti possono servire come modelli per le analisi accurate della tossicità causata da altre proteine mal ripiegate malattie associate a modelli lievito.
Questo manoscritto descrive tre approcci complementari sperimentali per misurare polyQ-tossicità nel lievito organismo modello basato sulla crescita ridotta di cellule di lievito che esprimono tossici polyQ-espansione proteine. Il lavoro nel lievito ha offerto profonde intuizioni sui meccanismi cellulari e molecolari di base di misfolding e la sua tossicità conseguente, compreso il misfolding e la tossicità del polyQ-espansione proteine 9,11,12. Esperimenti basati sui protocolli presentati qui hanno …
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro in laboratorio Duennwald è sostenuto da finanziamenti della American Federation for Aging Research (lontano), la Fondazione malattia ereditaria (HDF) e la Fondazione William Wood.
Name of instrument | Company | Catalogue number |
Frogger (6×8 pins) | V&P Scientific, San Diego | VP 407 AH |
BioscreenC | Growthcurves USA | 5101370 |
100-well Honeycomb plates | Growthcurves USA | 9602550 |