Vekst Analyser å vurdere Polyglutamine giftighet i Gjær
Summary
Dette manuskriptet beskriver tre komplementære protokoller for å vurdere toksisitet av polyglutamine (polyQ)-utvidelse proteiner i gjær<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Disse protokollene kan enkelt modifiseres for å overvåke toksisitet av andre misfolded proteiner i gjær.
Abstract
Protein misfolding er forbundet med mange menneskelige sykdommer, spesielt nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, og Huntingtons sykdom 1. Huntingtons sykdom (HD) er forårsaket av unormal utvidelse av en polyglutamine (polyQ) region innen protein huntingtin. Den polyQ-utvidede huntingtin protein oppnår en avvikende konformasjon (dvs. det misfolds) og forårsaker cellulær toksisitet to. Minst åtte ytterligere nevrodegenerative sykdommer er forårsaket av polyQ-utvidelser, inkludert Spinocerebellar Ataxias og Kennedys sykdom 3.
Modellen organismen gjær har muliggjort betydelige innsikt i cellulære og molekylære grunnlaget for polyQ-toksisitet, inkludert virkningen av intra-og inter-molekylære faktorer polyQ-toksisitet, og identifisering av cellulære mekanismer som er svekket i celler uttrykke polyQ-utvidelse proteiner 3-8. Viktigly, ble mange aspekter av polyQ-toksisitet som ble funnet i gjær gjengitt i andre eksperimentelle systemer og til en viss grad i prøver fra HD pasienter, og dermed demonstrerer betydningen av gjær modell for oppdagelsen av grunnleggende mekanismer som ligger til grunn polyQ-toksisitet.
En direkte og relativt enkel måte å bestemme polyQ-toksisitet i gjær er å måle vekst defekter i gjærceller uttrykker polyQ-utvidelse proteiner. Dette manuskriptet beskriver tre komplementære eksperimentelle tilnærminger for å fastslå polyQ-toksisitet i gjær ved å måle veksten av gjærceller uttrykker polyQ-utvidelse proteiner. De to første eksperimentelle tilnærminger overvåke gjær vekst på tallerkener, overvåker den tredje tilnærmingen veksten av flytende gjær kulturer bruker BioscreenC instrumentet.
Videre beskriver dette manuskriptet eksperimentelle vanskeligheter som kan oppstå ved håndtering av gjær polyQ modeller og skisserer strategier som vil bidra til å unngå ellerminimalisere disse vanskelighetene. Protokollene er beskrevet her kan brukes til å identifisere og karakterisere genetiske stier og små molekyler som modulerer polyQ-toksisitet. Videre kan de beskrevne analysene fungerer som maler for nøyaktige analyser av toksisitet forårsaket av andre sykdomsassosierte misfolded proteiner i gjær modeller.
Protocol
Discussion
Dette manuskriptet skisserer tre komplementære eksperimentelle tilnærminger for å måle polyQ-toksisitet i modellen organismen gjær basert på redusert vekst av gjærceller uttrykker giftige polyQ-utvidelse proteiner. Arbeid i gjær har tilbudt dype innsikt i grunnleggende cellulære og molekylære mekanismer av protein misfolding og dens påfølgende toksisitet, inkludert misfolding og toksisitet av polyQ-utvidelse proteiner 9,11,12. Eksperimenter basert på protokollene som presenteres her har allerede …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeid i Duennwald laboratoriet er støttet med tilskudd fra American Federation for aldring Research (Afar), den arvelige sykdommen Foundation (HDF) og William Wood Foundation.
Materials
| Name of instrument | Company | Catalogue number |
| Frogger (6×8 pins) | V&P Scientific, San Diego | VP 407 AH |
| BioscreenC | Growthcurves USA | 5101370 |
| 100-well Honeycomb plates | Growthcurves USA | 9602550 |
Riferimenti
- Soto, C., Estrada, L. D. Protein misfolding and neurodegeneration. Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington’s disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. Glutamine repeats and neurodegeneration. Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).
- Meriin, A. B. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).
- Duennwald, M. L., Lindquist, S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).
- Meriin, A. B. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells. J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).
- Gitler, A. D. Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Giorgini, F., Muchowski, P. J. Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast. Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).
- Ehrnhoefer, D. E. Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington’s disease models. Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).
