Ensaios de crescimento para avaliar a toxicidade poliglutamina em Levedura
Summary
Este manuscrito descreve três protocolos complementares para avaliar a toxicidade de poliglutaminas (poliQ)-expansão proteínas na levedura<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Estes protocolos podem ser facilmente modificados para monitorar a toxicidade de outras proteínas deformadas em levedura.
Abstract
Misfolding proteína está associada com várias doenças humanas, doenças neurodegenerativas particularmente, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington 1. Doença de Huntington (DH) é causada pela expansão anormal de uma região poliglutaminas (poliQ) dentro do huntingtina proteína. O poliQ-expandida proteína huntingtina atinge uma conformação aberrante (ie misfolds) e provoca toxicidade celular 2. Pelo menos oito outras doenças neurodegenerativas são causadas por poliQ de expansões, incluindo o AEC e doença de Kennedy 3.
A levedura organismo modelo facilitou insights significativos para a base celular e molecular de poliQ toxicidade, incluindo o impacto de fatores intra e inter-molecular de poliQ-toxicidade, bem como a identificação de caminhos celulares que são deficientes em células expressando poliQ expansão proteínas 3-8. Importantely, muitos aspectos poliQ-toxicidade que foram encontrados em levedura foram reproduzidas em outros sistemas experimentais e em certa medida em amostras de pacientes de HD, demonstrando assim a significância do modelo de levedura para a descoberta de mecanismos básicos subjacentes poliQ-toxicidade.
Uma forma direta e relativamente simples para determinar poliQ toxicidade em levedura é medir defeitos de crescimento de células de levedura que expressam poliQ expansão de proteínas. Este manuscrito descreve três complementares abordagens experimentais para determinar a toxicidade poliQ-em levedura através da medição do crescimento de células de levedura que expressam poliQ-expansão proteínas. As duas primeiras abordagens experimentais controlar o crescimento de leveduras em placas, a terceira abordagem monitora o crescimento de culturas de leveduras líquidos utilizando o instrumento BioscreenC.
Além disso, este manuscrito descreve dificuldades experimentais que podem ocorrer ao manusear modelos poliQ levedura e traça estratégias que ajudarão a evitar ouminimizar estas dificuldades. Os protocolos aqui descritos podem ser utilizados para identificar e caracterizar as vias genéticos e pequenas moléculas que modulam poliQ-toxicidade. Além disso, os ensaios descritos podem servir como modelos para análises precisas da toxicidade causada por outras doenças associadas a proteínas deformadas em modelos de levedura.
Protocol
Discussion
Este manuscrito descreve três abordagens complementares experimentais para medir poliQ toxicidade no organismo levedura modelo baseado na redução do crescimento de células de levedura que expressam tóxicos poliQ expansão de proteínas. Trabalho em levedura ofereceu profundos insights sobre os mecanismos básicos celulares e moleculares da misfolding proteína e sua toxicidade que se seguiu, incluindo o misfolding e toxicidade de poliQ expansão de proteínas 9,11,12. Experimentos baseados em protocolos …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho em laboratório Duennwald é suportado por concessões da Federação Americana para Pesquisas sobre o Envelhecimento (AFAR), a Fundação doença hereditária (HDF) e da Fundação William Wood.
Materials
| Name of instrument | Company | Catalogue number |
| Frogger (6×8 pins) | V&P Scientific, San Diego | VP 407 AH |
| BioscreenC | Growthcurves USA | 5101370 |
| 100-well Honeycomb plates | Growthcurves USA | 9602550 |
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