Die Messung der γHV68 Infektion bei Mäusen
Summary
γ-Herpesviren (γ-HVS) zu etablieren lebenslange Persistenz in ihrem Gastland. Die Infektion von Mäusen mit γ-HV68 bietet einen genetisch manipulierbaren<em> In vivo</em> Modell für die Charakterisierung des Lebenszyklus / Pathogenese der γHVs. Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis und die Quantifizierung von γHV68 Infektion bei akuten und latenten Stadium nach der Infektion durch Plaque-bildenden, Infektions-Center und qPCR-Assays.
Abstract
γ-Herpesviren (γ-HVS) zeichnen sich durch ihre Fähigkeit, latente Infektionen des lymphatischen Zellen 1 zu etablieren. Die engen Wirtsspektrum der menschlichen γ-HVS, wie EBV und KSHV hat stark detaillierte pathogene Studien erschwert. Murine γ-Herpesvirus 68 (γHV68) Aktien umfangreichen genetischen und biologischen Ähnlichkeiten mit menschlichen γ-HVS und ist eine natürliche Erreger der murid Nager 2. Als solche Auswertung γHV68 Infektion von Mäusen Inzuchtstämme in verschiedenen Stadien der Virusinfektion stellt ein wichtiges Modell für das Verständnis viralen Lebenszyklus und Pathogenese während γ-HVS-Infektion.
Nach intranasaler Inokulation γHV68 Infektion führt zu einer akuten Virämie in der Lunge, die später in eine latente Infektion von Splenozyten und anderen Zellen, die während der gesamten Lebensdauer des Wirtes 3,4 reaktiviert behoben werden können. In diesem Protokoll werden wir beschreiben, wie die Plaque-Assay zu beurteilen verwendens infektiösen Virustiter in der Lunge Homogenaten auf Vero-Zell-Monolayer in einem frühen Stadium (5 bis 7 Tage) von post-intranasale Infektion (dpi). Während einer akuten Infektion ist weitgehend geklärt 2 – 3 Wochen nach der Infektion, eine latente Infektion der γHV68 ist rund 14 dpi erstellt und fortgeschrieben später in der Milz der Mäuse. Latente Infektion in der Regel wirkt sich auf eine sehr kleine Population von Zellen in den infizierten Geweben, wobei das Virus bleibt ruhend und schaltet den größten Teil seiner Genexpression. Latent infizierte Splenozyten spontan reaktivieren Virus auf Explantation in Gewebekulturen, die durch einen infektiösen Center (IC)-Assay rekapituliert werden kann, um das virale latente Belastung zu bestimmen. Zur weiteren Abschätzung der Menge des viralen Genoms Kopien in der akut-und / oder latent infizierten Geweben, quantitative real-time PCR (qPCR) ist bekannt für seine maximale Empfindlichkeit und Genauigkeit verwendet. Die kombinierte Analyse der Ergebnisse der qPCR und Plaque-Assay, und / oder IC-Assay wird zeigen, der raum-zeitlichen Profile der viralenReplikation und Infektiosität in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 wurde weithin als Modell benutzt, um die Pathogenese der menschlichen γ-HVs 2,4,5 verstehen. In diesem Protokoll beschrieben wir drei routinemäßig eingesetzten Methoden, einschließlich Plaque-Assay für infektiöse Virustiter, IC-Assay für die virale latente Belastung und qPCR für virale Genom zu laden, um die akute und latente Infektion der γHV68 nach intranasaler Impfung bei Mäusen zu bewerten.
Die Plaque-Assay wurde intensiv an der Virustiter in den infizierten Z…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei der technischen Beratung und Unterstützung von Ren Sun (University of California, Los Angeles) und Seungmin Hwang (Washington University) bestätigen. Diese Arbeit wurde von der Baxter Foundation, National Institutes of Health gewährt (R01 und R21 CA140964 AI083841 C. Liang) finanziert.
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Riferimenti
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
