ΓHV68 संक्रमण के चूहे मापन
Summary
γ – Herpesviruses (γ-HVS) अपने मेजबान में जीवन भर अटलता की स्थापना. Γ-HV68 के साथ चूहों के संक्रमण एक आनुवंशिक विनयशील प्रदान करता है<em> Vivo में</em> जीवनचक्र / γHVs के रोगजनन के लक्षण वर्णन के लिए मॉडल. इस प्रोटोकॉल का पता लगाने और पट्टिका के गठन, संक्रामक केंद्र, और qPCR assays के द्वारा संक्रमण के बाद तीव्र और अव्यक्त चरणों में γHV68 संक्रमण के quantitation का वर्णन करता है.
Abstract
γ – Herpesviruses (γ-HVS) उनके lymphoid 1 कोशिकाओं की अव्यक्त संक्रमण स्थापित करने की क्षमता के लिए उल्लेखनीय हैं. मानव EBV और KSHV जैसे γ-HVS, संकीर्ण मेजबान रेंज, गंभीर विस्तृत रोगजनक पढ़ाई रुकावट है. Murine 68 γ herpesvirus (γHV68) γ-HVS और मानव के साथ व्यापक आनुवंशिक और जैविक समानता शेयरों murid 2 कृन्तकों की एक प्राकृतिक रोगज़नक़ है . जैसे वायरल संक्रमण के विभिन्न चरणों में जन्मजात उपभेदों चूहों के γHV68 संक्रमण के मूल्यांकन γ-HVS संक्रमण के दौरान वायरल जीवन चक्र और रोगजनन समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल उपलब्ध कराता है.
Intranasal टीका होने पर, γHV68 के फेफड़ों में तीव्र viremia में संक्रमण का परिणाम है कि बाद में splenocytes और अन्य कोशिकाओं है, जो 3,4 मेजबान के जीवन भर सक्रिय किया जा सकता का एक अव्यक्त संक्रमण में हल हो गई है. इस प्रोटोकॉल में, हम का वर्णन करेंगे कैसे गधे पट्टिका परख का उपयोग करने के लिएबाद intranasal संक्रमण (डीपीआई) के फेफड़ों में संक्रामक वायरस टिटर प्रारंभिक चरण (7 दिनों 5) में वेरो सेल monolayers पर homogenates. जबकि तीव्र संक्रमण काफी हद तक 2 को मंजूरी दे दी है – 3 सप्ताह postinfection, γHV68 की एक अव्यक्त संक्रमण डीपीआई 14 के आसपास की स्थापना की है पर बाद में चूहों की तिल्ली में बनाए रखा. अव्यक्त संक्रमण आमतौर पर संक्रमित ऊतकों में कोशिकाओं की एक बहुत छोटी आबादी को प्रभावित करता है, जिससे वायरस निष्क्रिय रहता है और अपने जीन की अभिव्यक्ति के सबसे बन्द हो जाता है. गुप्त रूप से संक्रमित splenocytes अनायास टिशू कल्चर है जो एक संक्रामक केंद्र परख (आईसी) के द्वारा recapitulated वायरल अव्यक्त लोड निर्धारित किया जा सकता है में explanting पर वायरस को पुन: सक्रिय. आगे तीव्रता और / या गुप्त रूप से संक्रमित ऊतकों, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर में वायरल जीनोम प्रतियां की राशि का अनुमान (qPCR) अपनी अधिक से अधिक संवेदनशीलता और सटीकता के लिए प्रयोग किया जाता है. qPCR और पट्टिका परख, और / या आईसी परख के परिणामों के संयुक्त विश्लेषण वायरल के spatiotemporal प्रोफाइल खोलेगाप्रतिकृति और vivo में संक्रामकता.
Protocol
Discussion
γHV68 व्यापक रूप से किया गया है एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल मानव γ-HVS 2,4,5 के रोगजनन को समझने की. इस प्रोटोकॉल में, हम तीन संक्रामक वायरस टिटर के लिए पट्टिका परख, वायरल अव्यक्त लोड करने के लिए आईसी परख, और वाय?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए रेन (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स) सूर्य और Seungmin ह्वांग (वाशिंगटन विश्वविद्यालय) से तकनीकी सलाह और समर्थन को स्वीकार करना होगा. यह काम बैक्सटर फाउंडेशन, राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य अनुदान के (CA140964 R01 और R21 सी. लिआंग AI083841) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Riferimenti
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