Måling av γHV68 Infeksjon i Mus
Summary
γ-herpesviruses (γ-HVS) etablere livslange utholdenhet i verten sin. Infeksjon av mus med γ-HV68 gir et genetisk medgjørlig<em> In vivo</em> Modell for karakterisering av livssyklusen / patogenesen av γHVs. Denne protokollen beskriver påvisning og kvantifisering av γHV68 infeksjon ved akutte og latente stadier følgende infeksjon av plakk-forming, smittsomme sentrum, og qPCR analyser.
Abstract
γ-herpesviruses (γ-HVS) er kjent for sin evne til å etablere latente infeksjoner av lymfoide celler 1. Den smale vert spekter av menneskelige γ-HVS, som EBV og KSHV har sterkt hindret detaljerte sykdomsfremkallende studier. Murint γ-herpesvirus 68 (γHV68) aksjer omfattende genetiske og biologiske likheter med menneskelige γ-HVS og er en naturlig patogen av murid gnagere 2. Som sådan, evaluering av γHV68 infeksjon av mus innavlede stammer på ulike stadier av viral infeksjon gir en viktig modell for å forstå viral livssyklus og patogenese ved γ-HVS infeksjon.
Ved intranasal inokulasjon, γHV68 infeksjon resulterer i akutt viremia i lungene som er senere løst inn i et latent infeksjon av splenocytes og andre celler, noe som kan reaktiveres gjennom hele livet av verten 3,4. I denne protokollen, vil vi beskrive hvordan du bruker plakett analysen å vurdereer smittsomt virus titer i lungene homogenates på Vero celle monolayers på et tidlig stadium (5-7 dager) etter intranasal infeksjon (dpi). Mens akutt infeksjon er i stor grad ryddet 2-3 uker postinfection, en latent infeksjon av γHV68 er etablert rundt 14 dpi og vedlikeholdes senere i milten av musene. Latent infeksjon vanligvis påvirker en svært liten populasjon av celler i infisert vev, der viruset forblir sovende og slår av de fleste av sine genuttrykk. Latent infisert splenocytes spontant reaktivere virus ved eksplantasjon i vev kultur, som kan rekapitulert av en smittsom sentrum (IC) assay å bestemme viral latent belastning. For ytterligere å anslå mengden av virale genomet eksemplarer i akutt og / eller latent infisert vev, kvantitativ real-time PCR (qPCR) brukes for maksimal følsomhet og nøyaktighet. Den kombinerte analyser av resultatene av qPCR og plakk analysen, og / eller IC analysen vil avsløre i tid og rom profiler av viralreplikering og smittsomhet in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 har vært mye brukt som modell for å forstå patogenesen av menneskelig γ-HVS 2,4,5. I denne protokollen, beskrev vi tre rutinemessig brukes metoder, inkludert plakk analysen for smittsomme virus titer, IC analysen for viral latent belastning, og qPCR for viral genomet belastning, å vurdere den akutte og latent infeksjon av γHV68 etter intranasal inokulasjon i mus.
Plakk analysen har vært brukt mye til å bestemme virus titer i infiserte celler eller vev, men den optim…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke de tekniske råd og støtte fra Ren Sun (University of California, Los Angeles) og Seungmin Hwang (Washington University). Dette arbeidet ble finansiert av Baxter Foundation, National Institutes of Health tilskudd (R01 CA140964 og R21 AI083841 til C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Riferimenti
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
