La medición de γHV68 infección en los ratones
Summary
γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma genética<em> En vivo</em> Modelo para la caracterización del ciclo de vida / patogenia de γHVs. Este protocolo describe la detección y cuantificación de γHV68 infección en las fases aguda y después de la infección latente por la placa de formación, centro de infecciosos, y los ensayos de PCR cuantitativa.
Abstract
γ-herpesvirus (γ-VS) se caracterizan por su capacidad para establecer infecciones latentes de las células linfoides 1. El rango de hospedadores de los derechos humanos γ-VS, como EBV y HVSK, ha obstaculizado seriamente los estudios detallados patógenos. Murinas herpesvirus γ-68 (γHV68) acciones amplias similitudes genéticas y biológicas con humanos γ-VS y es un patógeno natural de los roedores múridos 2. Como tal, la evaluación de γHV68 infección de ratones puras cepas en diferentes etapas de la infección viral constituye un modelo importante para la comprensión del ciclo de vida viral y patogenia en γ-VS infección.
Tras la inoculación intranasal, γHV68 infección da lugar a una viremia aguda en el pulmón que luego resuelve en una infección latente de esplenocitos y otras células, que puede ser reactivado durante la vida del huésped 3,4. En este protocolo, se describe cómo utilizar la placa de ensayo para evaluartítulo de s virus infeccioso en el pulmón homogeneizado en monocapas de células Vero en la primera etapa (5-7 días) después de la infección intranasal (dpi). Mientras que la infección aguda es en gran parte aclaró 2-3 postinfección semana, una infección latente de γHV68 se establece alrededor de 14 dpi y mantenido posteriormente en el bazo de los ratones. La infección latente por lo general afecta a una población muy pequeña de células en los tejidos infectados, por el cual el virus permanece latente y se apaga la mayor parte de su expresión génica. Esplenocitos latente infectadas por el virus de reactivar de manera espontánea en explante en cultivo de tejidos, que puede ser recapitulado en un centro de infecciosos (IC) de ensayo para determinar la carga viral latente. A fin de estimar la cantidad de copias del genoma viral en la forma aguda y / o tejidos con infección latente, la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se utiliza para su máxima sensibilidad y precisión. El análisis combinado de los resultados de ensayo qPCR y la placa, y / o ensayo de IC se muestran los perfiles de espacio-temporal de los virusla replicación y la infectividad in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 ha sido ampliamente utilizada como modelo para entender la patogénesis de los derechos humanos γ-VS 2,4,5. En este protocolo, se describen tres métodos de rutina utilizados, incluyendo la placa de ensayo para el título de virus infecciosos, ensayo de IC de la carga viral latente, y qPCR para la carga del genoma viral, para evaluar la infección aguda y latente de γHV68 después de la inoculación intranasal en ratones.
La placa de ensayo se ha utilizado ampliamente par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo y asesoramiento técnico de Ren Sol (Universidad de California, Los Angeles) y Seungmin Hwang (Universidad de Washington). Este trabajo fue financiado por la Fundación Baxter, los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (R01 y R21 CA140964 AI083841 a C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Riferimenti
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