الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام
Summary
قمنا بتطوير تقنية لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في المصنع. يتم تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة عن طريق نظام البوابة ، وتمكين التعبير عن البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق.
Abstract
قمنا بتطوير تقنية BiFC لاختبار التفاعل بين اثنين من البروتينات في الجسم الحي. ويتم تحقيق هذا عن طريق تقسيم البروتين أصفر فلوري (YFP) إلى قسمين شظايا غير متداخلة. هو استنساخ كل جزء في الإطار لجينة من الفائدة. ويمكن بعد هذه التركيبات يشترك في تحويلها إلى benthamiana نيكوتيانا عبر التحول بوساطة الأجرعية ، والسماح للتعبير العبور من البروتينات الانصهار. إعادة تشكيل إشارة YFP يحدث فقط عندما تتفاعل البروتينات التحقيق 1-7. لاختبار والتحقق من تفاعلات البروتين البروتين ، يمكن استخدام BiFC مع اثنين من الخميرة مقايسة (Y2H) المختلطة. وهذا قد كشف عن التفاعلات غير المباشرة التي يمكن التغاضي عنها في Y2H. بوابة التكنولوجيا منصة عالمية تتيح للباحثين المكوك الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) في كتعبير كثيرة وتحليل النظم الفنية و8،9 ممكن. لا يمكن الحفاظ على حد سواء اتجاه القراءة والإطار دون قيد أو باستخدام أنزيمات الربط لجعل التعبير عن استعداد الحيوانات المستنسخة. نتيجة لذلك ، يمكن للمرء أن القضاء على جميع الخطوات إعادة التسلسل لضمان تحقيق نتائج متسقة في جميع أنحاء التجارب. قمنا بإنشاء سلسلة من نواقل عبارة BiFC وY2H التي توفر للباحثين متوافق مع سهلة الاستخدام الأدوات اللازمة لأداء كل من المقايسات وBiFC Y2H 10. هنا ، علينا أن نظهر للتخفيف من استخدام نظامنا BiFC لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في N. benthamiana النباتات.
Protocol
Discussion
BiFC مقايسة هو أداة قوية لدراسة التفاعلات بين البروتينات. خلافا للمقايسة Y2H التقليدية ، ليس فقط BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات ، ولكنها توفر أيضا مزيدا من المعلومات من بروتين معقد مثل شبه الخلوية التوطين. أيضا ، فمن الممكن الكشف عن التفاعلات غير مباشرة م…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر السادس نغوين لقراءة المخطوطات والمساعدة العامة المختبر.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
Riferimenti
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
