איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת
Summary
פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.
Abstract
פיתחנו טכניקה BiFC לבחון את האינטראקציה בין שני חלבונים in vivo. מטרה זו מושגת על ידי פיצול חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לשני שברים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן של עניין. מבנים אלה אז יכול להיות שותף להפוך ניקוטיאנה benthamiana דרך טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium, המאפשר ביטוי במעבר של חלבונים היתוך. הכינון מחדש של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה 1-7. כדי לבדוק ולאמת את חלבונים אינטראקציות, BiFC ניתן להשתמש יחד עם שני assay שמרים (Y2H) היברידית. זה יכול לזהות אינטראקציות עקיף אשר ניתן להתעלם ב Y2H. הטכנולוגיה Gateway היא פלטפורמה אוניברסאלית המאפשרת לחוקרים המעבורת הגן של עניין (GOI) לתוך כביטוי רבים מערכות אנליזה פונקציונלית כמו 8,9 אפשרי. גם הכיוון ואת מסגרת הקריאה יכול להישמר ללא שימוש אנזימי הגבלה או קשירת להפוך מוכנים ביטוי שיבוטים. כתוצאה מכך, אפשר לחסל את כל סידור מחדש של צעדים כדי להבטיח תוצאות עקביות לאורך הניסויים. יצרנו סדרה של וקטורים BiFC תואם Gateway ו Y2H אשר לספק לחוקרים עם קל להשתמש בכלים כדי לבצע מבחני הן BiFC ו Y2H 10. כאן, אנו להדגים את קלות השימוש במערכת BiFC שלנו לבדוק חלבונים אינטראקציות נ benthamiana צמחים.
Protocol
Discussion
Assay BiFC הוא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון. בניגוד assay Y2H המסורתית, BiFC לא רק מאפשר הדמיה של חלבונים אינטראקציות, אלא גם מספק מידע יותר מורכב החלבון כגון בלוקליזציה המשנה הסלולר. כמו כן, ניתן לזהות אינטראקציות עקיפה, כל עוד שני חלבונים מועמד אפשר להביא מספיק קרוב על י…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים וי נגוין לקרוא את כתב היד וסיוע מעבדה כללית.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
Riferimenti
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
- Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions. Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).
- Hiatt, S. M. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45, 185-191 (2008).
- Barnard, E. Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast. Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nature. 1, 1278-1286 (2006).
- Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis. Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).
- Earley, K. W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).
- Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).
- Lu, Q. Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin. The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).
- Sparkes, I. A. transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants. Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).
- Demidov, V. V. Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nature. 3, 1693-1702 (2008).
