Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System
Summary
Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.
Abstract
Wir haben eine BIFC Technik, um die Interaktion zwischen zwei Proteinen in vivo-Test entwickelt. Dies wird durch Aufteilung eines gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in zwei nicht-überlappenden Fragmenten durchgeführt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse geklont. Diese Konstrukte können dann in Nicotiana benthamiana werden via Agrobacterium vermittelte Transformation co-transformiert, die den Transit Expression von Fusionsproteinen. Die Rekonstitution von YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteine 1-7 interagieren. Um zu testen und zu validieren das Protein-Protein-Interaktionen können BIFC zusammen mit Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Assay verwendet werden. Dies kann erkennen indirekten Wechselwirkungen, die in der Y2H übersehen werden kann. Gateway-Technologie ist eine universelle Plattform, die Forschern die Shuttle-Gens von Interesse (GOI) in so viele Expression und funktionelle Analyse-Systeme wie möglich zu 8,9. Sowohl die Orientierung und Leserahmen können ohne Verwendung von Restriktionsenzymen oder Ligation zum Ausdruck bereit-Klone machen aufrechterhalten werden. Als Ergebnis kann man beseitigen alle Re-Sequenzierung Schritte, um konsistente Ergebnisse in den Experimenten zu gewährleisten. Wir haben eine Reihe von Gateway kompatibel BIFC und Y2H Vektoren, die Forscher stellen mit einfach zu bedienenden Tools zu führen sowohl BIFC und Y2H Assays 10 erstellt. Hier zeigen wir die einfache Nutzung unserer BIFC System zum Protein-Protein-Interaktionen in N. Test benthamiana Pflanzen.
Protocol
Discussion
BIFC Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Protein-Interaktionen. Im Gegensatz zu den traditionellen Y2H Assay BIFC ermöglicht nicht nur die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen, sondern bietet auch weitere Informationen des Protein-Komplexes, wie sub-zelluläre Lokalisation. Auch ist es möglich, indirekten Wechselwirkungen so lange zu erkennen, wie die beiden Kandidaten Proteine nahe genug von einem dritten Partner gebracht werden. Wie jede Technologie hat BIFC seine Grenzen. Auf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Vi Nguyen für die Durchsicht des Manuskripts und allgemeine Labor Unterstützung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 |
| MES hydrate | Sigma | M2933 |
| 1 mL slip-tip tuberculin syringe | BD | 309602 |
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