RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em> In Vivo</em> Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em> Aedes aegypti</em> Muggen
Summary
In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing een<em> In vivo</em> Diurese test om de effecten knockdown van genen van belang te bestuderen heeft op muggen vloeistof excretie.
Abstract
Deze video protocol geeft blijk van een effectieve techniek om een bepaald gen in een insect knockdown en voert een nieuwe bioassay om de uitscheiding te meten. Deze methode kan worden gebruikt om een beter begrip van de werkwijze volgens diurèse in insecten verkrijgen en is bijzonder nuttig bij het bestuderen van diurèse in bloed geeft geleedpotigen die kunnen nemen grote hoeveelheden vloeistof in een bloedmaaltijd.
Deze RNAi-gemedieerde gen-knockdown in combinatie met een in vivo diurese test werd ontwikkeld door de Hansen lab om de effecten van RNAi-gemedieerde knockdown van aquaporine genen op Aedes aegypti mug diurese 1 te bestuderen.
Het protocol is ingesteld in twee delen: de eerste demonstratie laat zien hoe een eenvoudige injectie mug apparaat te maken en hoe voor te bereiden en dsRNA te injecteren in de thorax van muggen voor RNAi-gemedieerde gen knockdown. De tweede demonstratie illustreert hoe bepalenuitscheiding prijzen voor muggen met behulp van een in vivo bioassay.
Protocol
Discussion
De gebruikte RNAi-protocol is ontwikkeld in het laboratorium van Alexander Raikhel aan de Universiteit van Californië Riverside 6,7 en is vergelijkbaar met een protocol gepubliceerd door Garver en Dimopoulos 4. De experimentele benadering in deze video protocol kan worden gebruikt om genen in insect diurèse in een in vivo studie omgeving. De uitscheidingsorganen van insecten, de buisjes van Malpighi, hebben de interesse van de generaties van onderzoekers als een 'simpele' modelsy…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Victoria Carpenter voor haar kritische opmerkingen van dit protocol.
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
| Scissors | Local vendor | ||
| Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |
Riferimenti
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
