Leucin Rich Gentag kinase 2 er et stort multidomain kinase, mutationer i som er den mest almindelige genetiske årsag til Parkinsons sygdom. Analyse af kinase aktiviteten af dette protein har vist sig at være et afgørende redskab i forståelsen af biologi og dysfunktion af dette protein. I dette papir,<em> In vitro</em> Analysering af den kinase aktivitet LRRK2 og et udvalg af sine mutanter er beskrevet, hvilket giver et eksperimentelt system til at undersøge phosphorylering af formodede substrater og potentielle dysfunktion af LRRK2 i sygdom.
Leucin Rich Gentag kinase 2 (LRRK2) er en 2527 aminosyre medlem af ROCO familie af proteiner, der besidder en kompleks, multidomain struktur, herunder en GTPase domæne (kaldet ROC, for Ras af komplekse proteiner) og en kinase domæne 1. Opdagelsen i 2004 af mutationer i LRRK2, der forårsager Parkinsons sygdom (PD) resulterede i LRRK2 være fokus for en stor mængde forskning i sin normale funktion og hvordan proteinet går galt i sygdommen staten 2,3. Indledende undersøgelser af funktionen af LRRK2 fokuseret på sine enzymaktiviteter 4-6. Selv om et klart billede er endnu ikke opstå af en konsekvent ændring i disse på grund af mutationer, er data fra en række grupper fremhævede betydningen af den kinase aktivitet LRRK2 i celledød knyttet til mutationer 7,8. De seneste udgivelser har rapporteret hæmmere målrette kinase aktivitet LRRK2, hvilket giver en nøgle eksperimenter med 9-11. I lyset af disse data, er deter sandsynligt, at den enzymatiske egenskaber LRRK2 giver os et vigtigt indblik i biologi dette protein, selv om de er potentielle lægemiddelkandidater til behandling af Parkinsons er åben for debat.
En række forskellige tilgange har været brugt til analyse af kinase aktivitet LRRK2. Oprindeligt blev analyser udføres ved hjælp epitop taggede protein overudtrykt i mammale cellelinier og immunoprecipitated, med analyser foretaget med dette protein immobiliseret på agarose perler 4,5,7. Efterfølgende er renset rekombinant fragmenter af LRRK2 i opløsning også været brugt, for eksempel en GST mærket fragment oprenset fra insekt celler, der indeholder rester fra 970 til 2527 af LRRK2 12. For nylig rapporterede Daniels et al. Isolering af fulde længde LRRK2 i opløsning fra humane embryonale nyre celler, men dette protein er ikke almindeligt tilgængelig 13. I modsætning hertil afkortet den GST fusion form af LRRK2 er kommercielt tilrådighede (fra Invitrogen, tabel 1 for yderligere oplysninger se), og giver et praktisk værktøj til påvisning af en analyse for LRRK2 kinase aktivitet. Flere forskellige udgange til LRRK2 kinase aktivitet er blevet rapporteret. Autophosphorylation af LRRK2 sig selv, fosforylering af myelin Basic Protein (MBP) som et generisk kinase underlag og phosphorylering af en kunstig substrat – døbt LRRKtide, baseret på fosforylering af threonin 558 i Moesin – har alle været anvendt, som er en serie af formodede fysiologiske substrater herunder α-synuclein, Moesin og 4-EBP 14-17. Status af disse proteiner som substrater til LRRK2 fortsat uklart, og som sådan den protokol, der er beskrevet nedenfor, vil fokusere på at bruge MBP som en generisk substrat, idet anvendeligheden af dette system til analyse LRRK2 kinase aktivitet rettet mod en række potentielle substrater.
Denne afhandling beskriver et grundlæggende protokol for analysering af kinase aktivitet LRRK2 ved hjælp af en in vitro-system. Af hensyn til kortfattethed, har dette været begrænset til en times slutpunkt skabelon ved hjælp af en generisk substrat, men den generelle protokol gælder for en række potentielle substrater og gøres til genstand for mere avancerede analyser undersøge kinetik af den kinase aktivitet LRRK2 . Dette understreger en af de vigtigste fordele ved at bruge et di vitro system til at undersøge kinase opførsel af et protein som denne: fordi der ikke er fuld kontrol over koncentrationer af enzym og substrat, er det muligt at generere kinetiske data og beregne K m og V max værdier for reaktionen. For mere detaljerede kinetiske evalueringer eller evaluere virkningen af formodede-hæmmere, er en højere overførselshastighed system (som den, der ydes ved hjælp af LRRKtide substrat, der er tilgængelig fra Invitrogen) en overlegen alternativer,ve til den fremgangsmåde, der beskrives her.
Det er dog vigtigt at erkende, at den reduktionistiske model system leveret af in vitro-kinase assays er et af redskaberne til at undersøge biologi af en kinase og dens relationer med potentielle substrater. Data fra analyser som denne skal bruges sammen med andre tilgange for at få et omfattende billede af, hvordan en kinase opfører sig in vitro og i et trådløst sammenhæng. For eksempel kan en formodet substrat fosforyleret in vitro analyseres ved massespektrometri at identificere mulige phosphosites, som så kan manipuleres af målrettet mutagenese (f.eks. Konvertering af serin eller threonin fosfat acceptor rester to none-phosphorylatable restprodukter som alanin) for at undersøge den funktionelle konsekvenser af fosforylering ex vivo.
En central overvejelse i fortolkning af data fra en di vitro assay system som dette er sandsynligheden for eitheR type I eller type II (falsk positive eller falsk negative) fejl. Den reduktionistiske karakteren af dette system desværre afhænder det til begge – i tilfælde af førstnævnte, der har en renset formodet substrat og renset kinase i kunstigt nærheden af hinanden og i høj koncentration (i forhold til den cellulære miljø) kan resultere i kulturgenstandsspor fosforylering begivenheder. Omvendt er mange kinaser fungere som del af et komplekst inden for rammerne af cellen, og kræver co-faktorer for fosforylering af et givent substrat at forekomme. Som nævnt ovenfor, et positivt resultat ved fosforylering af en formodet substrat ved hjælp af en in vitro-system bør derefter testes i et trådløst system til at validere resultatet, og et negativt resultat bør fortolkes med forsigtighed.
I lyset af dette, er det afgørende, hvor det er muligt at have både positive og negative kontroller for at muliggøre en sammenlignende undersøgelse af aktiviteten i din kinase af interesse. Omhyggelig udvælgelse af en positiv control, der har en kendt aktivitet mod din protein af interesse, sammen med en negativ kontrol, der er usandsynligt, at phosphorylerer din formodede substrat, er yderst værdifuld. En kandidat kontrol for LRRK2 er Receptor interagerende kinase 3, der har et nært beslægtet primære sekvens til kinase domæne LRRK2, men har en meget forskellige overordnede domæne struktur 18. Dette er tilgængelig som rekombinant protein fra Invitrogen og bruges som en standard kontrol i vores laboratorium.
Det skal også bemærkes, at de kommercielt tilgængelige form af LRRK2 mangler den N-terminale ende af proteinet og er tagget med glutathion-S-transferase, og dette bør tages i betragtning som en potentiel forstyrrende faktor, når de udfører kinase assays med dette protein, da det ikke vides, hvilken rolle den N-terminale af LRRK2 kan spille i den normale funktion af dette protein. Hvis for eksempel brugte den N-terminale del af LRRK2, der er fraværende i proteinet i denne protokoler afgørende for rekruttering af et bestemt substrat til kinase domæne LRRK2 så vil det have stor indflydelse på de observerede fosforylering af sagde substrat i di vitro-systemet beskrevet ovenfor.
Selv med disse forbehold er det imidlertid vægt på biologi LRRK2 i Parkinsons forskning fremhæver nytten af denne protokol som et værdifuldt redskab til at undersøge adfærd af dette protein i en in vitro-indstilling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren er en af Parkinsons Storbritannien Research Fellow (tilskud F1002). Dette arbejde blev støttet delvist af Wellcome Trust / MRC Fælles Ring i neurodegeneration Award (WT089698) til det britiske Parkinsons Disease Consortium (UKPDC), hvis medlemmer er fra UCL Institute of Neurology, University of Sheffield og MRC Protein phosphorylering Unit ved University of Dundee.
Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
MBP | Sigma | M1891 | |
32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Equipment type | Company | Comment |
Geiger counter | Mini Instruments | |
SDS PAGE tank | Invitrogen | |
Transfer tank | Invitrogen | |
Heat blocks (2) | Eppendorf | |
Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
Phosphor imager | GE | |
Exposure cassette | GE | |
Centrifuge | Eppendorf | |
Perspex shielding | ||
1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment