富亮氨酸重复激酶2是一个大型的多域激酶,基因突变,其中最常见的帕金森氏病的遗传原因。这种蛋白激酶活性分析已被证明是在了解这种蛋白质的生物学和功能障碍的重要工具。在本文中,<em>在体外</em>化验的LRRK2激酶活性和描述及其突变体的选择,提供了一个实验系统研究假定基板和潜在的功能障碍疾病的LRRK2磷酸化。
富亮氨酸重 复激酶2(LRRK2)是一个2527氨基酸的蛋白质ROCO家族的成员,拥有一个复杂的,多域结构,包括一个GTP酶域(称为中华民国,复杂的蛋白质RAS)和一个激酶结构域1。 LRRK2突变LRRK2引起帕金森氏病(PD)在2004年发现导致体积庞大的研究重点,并到其正常功能的蛋白质如何去歪在疾病状态 2,3 。初步调查到的LRRK2的功能集中在 4-6酶活性。清晰的画面,虽然尚未出现在这些一致的改动由于突变,从一批批数据突出了LRRK2激酶活性在与突变7,8的细胞死亡的重要性。最近的出版物报道针对LRRK2激酶活性的抑制剂,提供了重要的实验工具9-11。鉴于这些数据,LRRK2的酶学性质,我们提供的这种蛋白质的生物学的一个重要窗口,虽然无论是帕金森氏症的潜在的药物靶标是公开辩论。
一些不同的方法已被用于检测激酶活性的LRRK2。最初,检测进行使用表位标记的蛋白在哺乳动物细胞中过度表达,免疫沉淀,进行检测,使用这种蛋白质固定在琼脂糖珠 4,5,7 。随后,纯化的重组解决方案LRRK2片段也被用来例如,GST标签的片段纯化昆虫细胞中含有残留LRRK2 12 970 2527。近日,丹尼尔斯等人的隔离解决方案,从人类胚胎肾细胞全长LRRK2,但这种蛋白质是没有广泛使用的13个。相比之下,GST融合截断LRRK2形式是商业availablE(Invitrogen公司,详见表1),并提供了一个方便的工具表明LRRK2激酶活性检测。 LRRK2激酶活性的几种不同的输出报告。根据Moesin 558苏氨酸的磷酸化,被称为LRRKtide – – LRRK2髓鞘碱性蛋白(MBP)作为一种通用的激酶底物和一个人工基质磷酸化,磷酸化的自身磷酸化都被用来作为有一系列公认的生理底物包括α-突触核蛋白,Moesin和4 EBP的14-17。这些蛋白质作为LRRK2基板的状态仍不清楚,下文所述的协议,将重点放在作为一种通用的基板使用MBP的检测LRRK2激酶活性,针对潜在的承印物范围,并指出这一制度的效用。
本文介绍了一种用于化验的LRRK2的激酶活性,在体外系统的基本协议。在简洁的利益,这已不限于一小时的终点模板,使用一个通用的基板,但一般协议是适用于潜在的承印物范围,适合更复杂的分析研究LRRK2激酶活性的动力学。这突出表明利用体外系统研究,像这样的一种蛋白激酶行为的关键优势之一:酶和底物的浓度,因为有完整的控制,它可以生成动力学数据和计算的K m和V 最大值反应。对于更详细的动力学评价或公认的抑制剂的影响进行评估的,更高的吞吐量系统(如使用LRRKtide基板,自Invitrogen提供)的是一个优越的alternati已经在这里介绍的方法。
这一点很重要,但是,认识到还原模型在体外激酶分析系统提供的是一个工具来检查生物学激酶和其潜在基板之间的关系。像这样的检测数据应在与其他方法结合使用激酶如何在体外和行为在一个细胞的背景下,以获得全面的了解。例如, 在体外磷酸化的一个公认的基板可以通过质谱分析,以确定有针对性的突变(如转换的丝氨酸或苏氨酸磷酸受体残基丙氨酸,如无phosphorylatable残留),然后可以通过操纵研究功能可能phosphosites磷酸体外的后果。
在体外检测系统如在解释数据的一个主要考虑因素是eithe可能性R型I或II型错误(假阳性或假阴性)。不幸的是,该系统的还原性质作主既 – 在前者的情况下,有一个纯化假定在人为地接近,并在高浓度的底物和纯化激酶(蜂窝环境相比)可能会导致artefactual磷酸化事件。相反,作为一个复杂的一部分,许多激酶的功能内的细胞中,并要求一个给定的基材发生磷酸化的共同因素。如上所述,从一个假定的底物磷酸化的积极结果在体外检测系统使用,那么应该是在蜂窝系统测试验证结果和阴性结果应谨慎解释。
鉴于这种情况,这是关键,可能有正反两方面的控制,让您感兴趣的激酶活性的比较研究。仔细选择了积极控器升,有一个对你感兴趣的蛋白质知名的活动,与阴性对照,是不太可能的磷酸化公认的基板,是极其宝贵的。一个LRRK2候选人控制受体相互作用的激酶3,其中有一个密切相关的主序列激酶结构域的LRRK2,但有一个非常不同的总体域结构18。这是从Invitrogen公司的重组蛋白,并作为标准控制在我们的实验室使用。
还应当指出的是,市售的LRRK2形式缺乏的蛋白质N -末端和谷胱甘肽- S -转移,这应该被视为一个潜在的混杂因素考虑在进行这种蛋白激酶检测标签,因为它是不知道什么样的作用N -末端的LRRK2这种蛋白质发挥正常功能。例如,如果在这个协议中的部分是缺席的蛋白质N -末端的LRRK2是招聘的LRRK2激酶结构域的一个特定的基板关键,那么这将有一个观察磷酸化产生重大影响,在体外系统的基板上面描述。
即使这些前提条件,然而,帕金森氏研究LRRK2生物学的重要性,强调作为一个有价值的工具,在调查这种蛋白质的行为 ,在体外设置本议定书的效用。
The authors have nothing to disclose.
作者是帕金森的英国研究员(补助金F1002)。这项工作是支持部分由威康信托/湄公河委员会联合呼叫在神经退行性疾病奖(WT089698)的英国帕金森的疾病联盟(UKPDC)的神经学伦敦大学学院研究所,在谢菲尔德大学和在湄公河蛋白磷酸化组在邓迪大学。
Reagent | Company | Catalogue Number | Comment |
LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
Kinase buffer | Cell Signalling | 9802S | |
MBP | Sigma | M1891 | |
32P g ATP | Perkin Elmer | BLU002X500UC | 500µCi, 30Ci /mMole |
4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 |
Table 1. Reagents
Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps
Equipment type | Company | Comment |
Geiger counter | Mini Instruments | |
SDS PAGE tank | Invitrogen | |
Transfer tank | Invitrogen | |
Heat blocks (2) | Eppendorf | |
Phosphor screen | GE | X-ray film can be substituted |
Phosphor imager | GE | |
Exposure cassette | GE | |
Centrifuge | Eppendorf | |
Perspex shielding | ||
1.5ml tubes | VWR | Screw top with O ring |
Table 2. Equipment