钙调蛋白结合蛋白的下拉

Summary

钙调蛋白（CAM）下拉实验调查与各种蛋白质的CaM的相互作用的有效途径。此方法使用效率和具体分析CaM结合蛋白钙调素琼脂糖珠。这提供了一个重要的工具，探索细胞功能的CAM信号。

Abstract

钙（ ^钙离子）离子通过多种机制调节细胞功能的重要。大部分的Ca ^{2 +}信号是通过介导的钙结合蛋白称为钙调蛋白^（CAM） 1,2。 CAM是涉及多层次的，在几乎所有的细胞过程，包括细胞凋亡，代谢，平滑肌收缩，突触可塑性，神经生长，炎症和免疫反应。的蛋白质，帮助调节与CAM的互动关系，通过这些途径。许多这些相互作用依赖于CaM的构象，这是明显不同的CA ^{2 +（}的Ca ^{2 +} – CAM）作为反对它的Ca ^{2 +}自由状态^{（ApoCaM）3}时，势必。

虽然大多数靶蛋白结合的Ca ^{2 +} – CAM，某些蛋白质只能绑定到ApoCaM。有的通过他们的智商域绑定CAM，包括neuromodulin的^{NG（NG）5，4，}和一定的肌球蛋白<sup> 6。这些蛋白质已被证实，分别在突触前功能性突触后功能^8，和肌肉的收缩⁹发挥的重要作用。他们的结合能力，并^释放钙的缺乏或存在^的 CAM +是在其功能的关键。相比之下，许多蛋白质结合的Ca ^{2 +} – CAM，并要求其激活这个约束力。例子包括肌球蛋白轻链激酶¹⁰的Ca ^{2 +} / CaM依赖的蛋白激酶^{（CaMKs）11}和磷酸酶（如钙调磷酸酶^）12，和血影蛋白激酶^13，其中有各种直接和下游的影响^14。

这些蛋白质对细胞功能的影响往往依赖于自己的能力结合到CAM中的Ca ^{2 +}依赖性。例如，我们测试的NG – CAM约束力的突触功能的相关性和不同的基因突变如何影响这个约束力。我们生成一个GFP标记的吴CON结构与特定的突变，在IQ域会改变伍CAM中的Ca ² +依赖性的结合能力。这些不同的基因突变的研究给了我们很大的启示，为参与突触^功能的8,15的重要进程。然而，在这些研究中，它是必不可少的证明突变的蛋白质有约束力凸轮预期改变。

在这里，我们目前为检测蛋白质的能力绑定到CAM的Ca ² +的存在或缺乏，作为例子使用CaMKII和NG方法。这种方法是一种亲和层析的形式简称为CAM的下拉检测。它使用的CaM -琼脂糖珠测试蛋白质结合CAM与此绑定的Ca ^{2 +}的影响。这是相当多的时间效率和需要较少的蛋白质相柱层析及其他实验。总之，这提供了一个宝贵的工具，以^探索的Ca ² + / CaM的信号和蛋白质，在teract与CAM。

Protocol

一个过程的开始与匀浆的基本原理，请参考图1。估计，从细胞中提取的准备钙调素结合蛋白洗脱的时间是6至7小时。 1。组织编制注入病毒包含利益的重组蛋白（在这个例子中，绿色荧光蛋白（GFP）标记伍），并允许组织一夜之间表达蛋白表达质粒器官海马。 病毒注射后约12至18小时（取决于病毒表达时间），准备收集组织。加入1ml清扫缓冲区（10MM葡萄糖，4mm?…

Discussion

提供的协议利用CaM的琼脂糖珠调查的Ca ^{2 +}依赖CaM结合蛋白。许多蛋白质结合CAM中的Ca ^{2 +}依赖性。这些相互作​​用CaM结合蛋白的数量和他们的许多信号通路中的关键作用给予高度重视。在这个协议中，CAM – Sepharose树脂用于组织匀浆中的Ca ^{2 +}的存在或缺乏独立于CaM结合蛋白。这个简单的方法的结果将进一步了解蛋白质如何与CAM中的Ca ^{2 +}依赖的方式进行交互。这种方?…

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads