Pull-down von Calmodulin-bindende Proteine

Summary

Calmodulin (CaM) Pull-Down-Assay ist ein effektiver Weg, um die Interaktion von CaM mit verschiedenen Proteinen zu untersuchen. Diese Methode verwendet CaM-Sepharose-Kügelchen für eine effiziente und spezifische Analyse von CaM-bindenden Proteinen. Dies stellt ein wichtiges Instrument zur CaM-Signalisierung in zelluläre Funktion zu erforschen.

Abstract

Calcium (Ca ^{2 +)} ist ein Ion wichtig bei der Regulation zellulärer Funktionen durch eine Vielzahl von Mechanismen. Ein Großteil der Ca ^{2 +-Signalisierung} wird durch die Calcium-bindende Protein als Calmodulin (CaM) ^1,2 bekannt vermittelt. CaM ist auf mehreren Ebenen in fast allen zellulären Prozessen, einschließlich Apoptose, Metabolismus, Kontraktion der glatten Muskulatur, die synaptische Plastizität, nerve growth, Entzündungen und der Immunantwort beteiligt. Eine Reihe von Proteinen zu regulieren diese Wege durch ihre Interaktion mit CaM. Viele dieser Wechselwirkungen hängen von der Konformation des CaM, die deutlich anders ist als an Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CaM)} an seiner Ca ^{2 +-freien} Zustand (ApoCaM) ³ gegenüber gebunden.

Während die meisten Zielproteine ​​binden Ca ^{2 +-CaM,} bestimmte Proteine ​​binden nur an ApoCaM. Einige binden CaM durch ihre IQ-Domäne, einschließlich neuromodulin ^4, neurogranin (Ng) ^5, und bestimmte Myosin <sup> 6. Diese Proteine ​​haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in präsynaptischen Funktion ^7, postsynaptische Funktion ⁸ und Muskelkontraktion ⁹ Spielen jeweils. Ihre Fähigkeit zur Bindung und Freisetzung CaM in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Ca ^{2 +} ist von zentraler Bedeutung in ihrer Funktion. Im Gegensatz dazu viele Proteine ​​binden nur Ca ^{2 +-CaM} und benötigen diese Bindung für ihre Aktivierung. Beispiele hierfür sind Myosin Light Chain Kinase ^10, Ca ^{2 +} / CaM-abhängigen Kinasen (CaMKs) ¹¹ und Phosphatasen (zB Calcineurin) ^12, und Spektrin Kinase ^13, die eine Vielzahl von direkten und nachgelagerten Auswirkungen ^{14 aufweisen.}

Die Auswirkungen dieser Proteine ​​auf die zelluläre Funktion sind oft abhängig von ihrer Fähigkeit, an CaM in einem Ca ^{2 +-abhängigen} Weise zu binden. Zum Beispiel haben wir getestet, die Relevanz der Ng-CaM Bindung in synaptische Funktion und wie verschiedene Mutationen dieser Bindung beeinflussen. Wir erzielten ein GFP-markierten Ng construct mit spezifischen Mutationen in den IQ-Domäne, die die Fähigkeit des Ng zu CaM in einem Ca ^{2 +-abhängigen} Weise zu binden verändern würde. Die Untersuchung dieser verschiedenen Mutationen gab uns einen großartigen Einblick in wichtige Prozesse der synaptischen Funktion ^8,15 beteiligt. Doch in solchen Studien ist es wichtig zu zeigen, dass die mutierten Proteine ​​der erwarteten veränderten Bindung an CaM haben.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Prüfung der Fähigkeit von Proteinen an CaM in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Ca ^{2 +} binden, mit CaMKII und Ng als Beispiele. Diese Methode ist eine Form der Affinitätschromatographie bezeichnet als CaM Pull-Down-Assay. Es nutzt CaM-Sepharose Perlen Proteine, die an CaM und den Einfluss der Ca ^{2 +} auf diese Bindung binden zu testen. Es ist wesentlich mehr Zeit effizienter und erfordert weniger Protein relativ zur Säulenchromatographie und andere Assays. Insgesamt bietet diese zu einem wertvollen Werkzeug zur Ca ^{2 +} / CaM-Signalisierung und Proteine, die in erkundenteract mit CaM.

Protocol

Siehe Abbildung 1 für eine Prinzipskizze des Verfahrens, beginnend mit dem Homogenat Abbildung. Geschätzte Zeit von der Vorbereitung der zellulären Extrakte Elution von CaM-Proteine ​​ist ca. 6-7 Stunden. 1. Tissue Vorbereitung Inject organotypischen Schnitten des Hippocampus mit einem Virus mit einem Plasmid, das rekombinante Protein von Interesse (in diesem Beispiel grün fluoreszierende Protein (GFP)-markierten Ng) und erlauben Gewebe Protein Nachtexpress. Etwa…

Discussion

Die zur Verfügung gestellten Protokoll verwendet CaM-Sepharose-Kügelchen, die Ca ^{2 +-Abhängigkeit} der CaM-bindenden Proteinen zu untersuchen. Viele Proteine ​​binden CaM in einem Ca ^{2 +-abhängigen} Weise. Diese Wechselwirkungen sind von großer Bedeutung angesichts der Zahl der CaM-bindende Proteine ​​und ihre entscheidende Rolle in vielen Signalwegen. In diesem Protokoll werden CaM-Sepharose-Kügelchen verwendet, um CaM-bindenden Proteinen aus Gewebehomogenat separaten in die Gegenwart …

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads