Kalmodulin bağlayıcı Proteinler, Pull-down
Summary
Kalmodulin (CAM) açılan test CaM çeşitli proteinler ile etkileşimi araştırmak için etkili bir yoldur. Bu yöntem, etkili ve spesifik CaM-bağlayıcı proteinlerin analizi için CaM-sepharose boncuk kullanır. Bu hücresel fonksiyonları CaM sinyal keşfetmek için önemli bir araç sağlar.
Abstract
Kalsiyum (Ca 2 +), çeşitli mekanizmalar aracılığıyla hücresel fonksiyonları düzenleyen hayati bir iyon . Ca 2 + sinyalizasyon kalmodulin (CaM) 1,2 olarak bilinen kalsiyum-bağlayıcı protein aracılığıyla. CaM apoptoz, metabolizma, düz kas kasılması, sinaptik plastisite, sinir büyüme, enflamasyon ve immün yanıt da dahil olmak üzere hemen hemen tüm hücresel süreçleri birden fazla seviyelerde yer almaktadır. Proteinlerin bir dizi CaM ile etkileşim yoluyla bu yollar düzenlenmesine yardımcı olurlar. Bu etkileşimlerin bir çoğu, Ca 2 +, Ca 2 +-devlet (ApoCaM) 3 karşı (Ca 2 +-CaM) bağlı farklı CaM, konformasyon bağlıdır .
Çoğu hedef proteinlere Ca 2 bağlama iken + CaM, bazı proteinler sadece ApoCaM bağlamak. Neuromodulin 4, neurogranin (Tr) 5, ve belirli Miyosinler de dahil olmak üzere kendi IQ etki alanı ile Bazı bağlama CaM <sup> 6. Bu proteinler, sırasıyla, presinaptik fonksiyonu 7, 8 postsinaptik fonksiyonu, ve kas kasılması 9 önemli rol oynamaktadır gösterilmiştir . Bağlamak ve Ca 2 varlığı veya yokluğu CaM serbest + yeteneklerini kendi fonksiyonu çok önemlidir. Buna karşılık, birçok proteinler sadece Ca 2 +-CaM bağlamak ve onların aktivasyonu için bu bağlayıcı gerektirir. Örnekler miyozin hafif zincir kinaz 10, Ca 2 + / CaM-bağımlı kinazlar (CaMKs) 11 ve fosfatazlar (örneğin kalsinörin) 12 ve 14 doğrudan ve mansap etkileri bir çeşitlilik var spectrin kinaz 13, içerir.
Bu proteinlerin hücre fonksiyonu üzerinde etkileri genellikle CaM Ca 2 +-bağımlı bir şekilde bağlamak için yeteneklerini bağlıdır. Örneğin, farklı mutasyon bu bağlayıcı nasıl etkilediğini sinaptik fonksiyon Tr-CaM bağlama uygunluğu test edilmiş ve. Biz bir GFP etiketli Ng con oluşturulanNg, Ca 2 +-bağımlı bir şekilde CaM bağlamak yeteneğini değiştirmek istiyorsunuz IQ etki alanında belirli mutasyonları ile yapı . Sinaptik fonksiyon 8,15 yer alan önemli süreçler, bu farklı mutasyonlar çalışma bize büyük bir fikir verdi. Ancak, bu tür çalışmaların, mutasyona uğramış proteinler CaM beklenen değiştirilmiş bağlayıcı sahip olduklarını göstermeleri şarttır.
Burada, örnek olarak CaMKII ve Ng kullanarak, Ca 2 + varlığı ya da yokluğu CaM bağlamak için proteinlerin yeteneğini test etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem afinite kromatografisi CaM açılan test olarak adlandırılan bir form. CaM-sepharose boncuk CaM ve Ca 2 + bağlayıcı bir etkisi bağlayan proteinleri test etmek için kullanır. Bu verimli, çok daha fazla zaman ve kolon kromatografisi ve diğer testleri göre daha az protein gerektirir. Toplamda, bu Ca 2 + / CaM sinyalizasyon ve proteinlerin ki keşfetmek için değerli bir araç sağlarCaM ile teract.
Protocol
Discussion
Ca 2 +-CaM-bağlayıcı proteinlerin bağımlılığı araştırmak için sağlanan protokol CaM-sepharose boncuk kullanır. Çoğu protein, Ca 2 +-bağımlı bir şekilde CaM bağlanır . Bu etkileşimler CaM-bağlayıcı proteinlerin ve birçok sinyal yolakları kritik bir rol sayısı göz önüne alındığında büyük önem taşımaktadır. Bu protokol, CaM-sepharose boncuk CaM-bağlayıcı proteinlerin varlığı ya da yokluğu, Ca 2 + doku Homojenat ayırmak için kullanılır . …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu protokol optimize ona yardım Tiffany Kiraz teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (AG032320) yanı sıra Sağlıklı Wisconsin ilerlemek tarafından finanse edildi.
Materials
| Product | Company | Catalogue number | Notes |
| Calmodulin-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0529-01 | |
| Anti-CamKII alpha | Sigma-Aldrich | C6974 | |
| Anti-neurogranin | Millipore | 07-425 | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher | 02-707-138 | Use for aspiration of supernatants |
| Microcentrifuge tubes (2.0 mL) | Fisher | 05-408-146 | Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads |
Riferimenti
- Vincenzi, F. F. Calmodulin in the regulation of intracellular calcium. Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).
- Cheung, W. Y. Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation. Science. 207, 19-27 (1980).
- Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).
- Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein. J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).
- Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain. Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).
- Bahler, M., Rhoads, A. Calmodulin signaling via the IQ motif. FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).
- Routtenberg, A. Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth. Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).
- Needham, D. M. Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction. Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).
- Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).
- Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain. J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).
- Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).
- Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes. Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).
- Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. Calmodulin’s flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides. Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
