Het meten van Fast Calcium stromen in cardiomyocyten

Summary

Wij presenteren een methode om snel (microseconde) calcium gebeurtenissen isoleren van trager stromen in levende cellen met behulp van laser scanning confocale microscopie. De methode meet fluorescentie-intensiteit schommelingen van calcium indicatoren door het opnemen van lijn scans van enkele honderden pixels in een cel. Histogram-analyse laat ons toe om te isoleren van de tijdschalen van de verschillende calcium fluxen.

Abstract

Cardiomyocyten meerdere Ca ^{2 +} fluxen van verschillende duur die samenwerken om de functie ^1,2 te optimaliseren. Veranderingen in de Ca ^{2 +-activiteit} in reactie op extracellulaire agenten wordt voornamelijk geregeld door de fosfolipase Cβ-Gα _q pad gelokaliseerd op de plasmamembraan, die wordt gestimuleerd door stoffen zoals acetylcholine ^3,4. We hebben onlangs ontdekt dat plasma-membraan eiwit domeinen genaamd caveolae ^5,6 kan Gα _q ⁷ vangen geactiveerd. Dit entrapment heeft het effect van de stabilisatie van de geactiveerde toestand van Gα _q en resulteert in een verlengde Ca ^{2 +-signalen} in cardiomyocyten en andere celtypes ^8. We ontdekte dit verrassende resultaat door het meten van dynamische calcium antwoorden op een snelle schaal in de levende hartspiercellen. In het kort worden cellen geladen met een fluorescerende Ca ^{2 +-indicator.} In onze studies hebben we gebruik gemaakt Ca ^{2 +} Green (Invitrogen, Inc.), die een toename van de fluorescentie-emissie-intensiteit bij de binding van calciumionen vertoont. De fluorescentie-intensiteit wordt vervolgens opgenomen voor het gebruik van een line-scan modus van een laser scanning confocale microscoop. Deze methode maakt een snelle overname van het tijdsverloop van de fluorescentie-intensiteit in pixels langs een geselecteerde lijn, het produceren van enkele honderden van de tijd sporen op de microseconde tijdschaal. Deze zeer snelle sporen worden overgebracht naar Excel en vervolgens in Sigmaplot voor analyse, en worden vergeleken met sporen verkregen voor elektronische ruis, gratis verf, en andere controles. Te ontleden Ca ^{2 +} reacties van verschillende fluxen, voerden we een histogram analyse die pixel intensiteiten weggegooid met de tijd. Binning laat ons toe om de groep meer dan 500 sporen van scans en visualiseren van de verzamelde resultaten van ruimte en tijd op een perceel. Zo kan de trage Ca ^{2 +} golven die moeilijk te onderscheiden wanneer de scans worden bedekt te wijten aan verschillende piek plaatsing en geluid, gemakkelijk te zien inhet weggegooid histogrammen. Zeer snel fluxen in de tijdschaal van de meting tonen een smalle verdeling van de intensiteiten op de zeer korte tijd bakken terwijl meer Ca ^{2 +} golven tonen weggegooid gegevens met een brede spreiding over langere tijd bakken. Deze verschillende verdelingen tijd kunnen we de timing van Ca ^{2 +} fluxen ontleden in de cellen, en het effect daarvan te bepalen op verschillende cellulaire gebeurtenissen.

Protocol

1. Het laden van cellen met calcium indicatoren Plaat cellen in 35mm met glazen bodem MatTek gerechten (of enige andere met glazen bodem bekijken van kamers). Bij gebruik van primaire myocyten de vacht van de kamers een dag eerder met 10μg/ml laminine. Plaat cardiale myocyten (geïsoleerd van volwassen honden, neonatale ratten of ander organisme) in KB buffer (K-omkering Tyrode buffer 35 mmol / L van HEPES, 140 mmol / L KCl, 8 mmol / L van KHCO 3, 2 mmol / L van MgCl 2, en 0,4…

Discussion

We hebben een methode ontwikkeld om te bekijken en te snelle calcium-signalen te isoleren in levende hartspiercellen. Terwijl de experimentele omstandigheden van deze metingen zijn eerder toegepast op andere celsystemen ¹⁰ en cardiomyocyten ^11, het gebruik van histogrammen en bin-analyse maakt het mogelijk gegevens uit vele Ca ^{2 +} evenementen aan te schaffen. Sneller gebeurtenissen kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit langzamere en modellen aangepast aan hun onderliggende mechanisme…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234