Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

Sommario

Vi presentiamo un metodo per isolare rapido (microsecondi) eventi di calcio da più lenti flussi nelle cellule viventi mediante microscopia confocale a scansione laser. Il metodo di misura fluttuazioni di intensità di fluorescenza di indicatori di calcio da scansioni di registrazione linea di diverse centinaia di pixel in una cella. Analisi istogramma permette di isolare la scale temporali dei flussi di calcio diverse.

Abstract

Cardiomiociti hanno più Ca ^{2 +} flussi di durata variabile che lavorano insieme per ottimizzare ^1,2 funzione. Variazioni di Ca ^{2 +} attività in risposta ad agenti extracellulare è prevalentemente regolata dalla fosfolipasi Cβ-Gα percorso _q localizzato sulla membrana plasmatica, che è stimolata da agenti come l'acetilcolina ^3,4. Abbiamo recentemente scoperto che i domini delle proteine ​​della membrana plasmatica chiamato caveolae ^5,6 può intrappolare attivato Gα _q ^7. Questo intrappolamento ha l'effetto di stabilizzare lo stato di attivazione Gα _q e conseguente prolungata Ca ^{2 +} segnali in cardiomiociti e altri tipi di cellule ^8. Abbiamo scoperto questo sorprendente risultato misurando le risposte di calcio dinamica su scala veloce in cardiomiociti viventi. In breve, le cellule vengono caricati con un indicatore fluorescente Ca ^{2 +.} Nei nostri studi, abbiamo usato Ca ^{2 +} Verde (Invitrogen, inc.) che mostra un aumento di intensità di emissione di fluorescenza dal legame di ioni calcio. L'intensità della fluorescenza è quindi registrato per l'utilizzo di una linea-modalità di scansione di un microscopio confocale a scansione laser. Questo metodo permette una rapida acquisizione della durata di intensità di fluorescenza in pixel lungo una retta, la produzione di diverse centinaia di tracce tempo sulla scala temporale microsecondo. Queste tracce sono molto veloci trasferiti in Excel e poi in SigmaPlot per l'analisi, e sono confrontati con le tracce ottenute per il rumore elettronico, senza coloranti e altri controlli. Per sezionare Ca ^{2 +} risposte di tassi di flusso differenti, abbiamo effettuato una analisi istogramma che cestinate intensità di pixel con il tempo. Binning ci permette di raggruppare più di 500 tracce di scansioni e visualizzare i risultati compilato spazialmente e temporalmente in un unico appezzamento. Così, il lento Ca ^{2 +} che le onde sono difficili da discernere quando le scansioni sono sovrapposti a causa di diversi posizionamento di picco e rumore, può essere facilmente visto ingli istogrammi cestinate. Flussi molto veloce nella scala temporale della misura mostrano una stretta distribuzione di intensità nelle celle tempi molto brevi, mentre più di Ca ^{2 +} onde mostrare i dati cestinate con una distribuzione più ampia cassonetti tempo più lungo. Queste distribuzioni di tempo diversi ci permettono di analizzare i tempi di Ca ^{2 +} flussi nelle cellule, e di determinare il loro impatto sui vari eventi cellulari.

Protocollo

1. Celle di carico con indicatori di calcio

1. Cellule piastra in piatti di 35 millimetri dal fondo di vetro MatTek (o qualsiasi altro fondo di vetro visione camere).
2. In caso di utilizzo primario cappotto miociti delle camere 1 giorno prima con 10μg/ml laminina. Miociti cardiaci piastra (isolata da cani adulti, ratti neonati, o altro organismo) in KB del buffer (K-inversione del buffer Tyrode 35 mmol / L di HEPES, 140 mmol / L di KCl, 8 mmol / L di KHCO _3, 2 mmol / L di MgCl _2, e 0,4 mmol / L di KH ₂ PO _4, pH 7,5) e il cambiamento in modo graduale per M199 media integrato con il 15% di siero fetale bovino ....

Discussione

Abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare ed isolare i segnali di calcio rapido cardiomiociti viventi. Mentre le condizioni sperimentali di queste misurazioni sono state precedentemente applicata ai sistemi cellulari altri ¹⁰ così come cardiomiociti ^11, l'utilizzo di istogrammi e di analisi bin consente ai dati di molti Ca ^{2 +} eventi da acquisire. Più veloce eventi possono essere facilmente isolate da quelli lenti e modelli adattati a comprendere i meccanismi sottostanti. Cardiom.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Invitrogen	ABCD1234