Un modo rapido per condurre immunocolorazione cuore embrionale di zebrafish è descritto. Rispetto alla intero approccio immunostaining monte, questo metodo aumenta notevolmente la penetrazione degli anticorpi, che permette di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano strutture cellulari / subcellulari nel cuore entro un tempo di elaborazione molto più ridotto.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zebrafish embrione diventa un popolare modello vertebrato vivo per lo studio dello sviluppo delle malattie cardiache e cuore umano grazie alla sua vantaggiosa embriologia e genetica 1,2. Circa 100-200 embrioni sono disponibili ogni settimana da una singola coppia di pesci adulti. Gli embrioni che si sviluppano in utero trasparente ex li rendono ideali per la valutazione dei difetti cardiaci 3. L'espressione di un gene può essere manipolato tramite morfolino tecnologia o RNA iniezione 4. Inoltre, in avanti schermi genetici hanno già generato una lista di mutanti che interessano diverse prospettive di cardiogenesis 5.
Tutto immunocolorazione mount è una tecnica importante in questo modello animale per rivelare il pattern di espressione della proteina bersaglio di un particolare tessuto 6. Tuttavia, le immagini ad alta risoluzione che possono rivelare le strutture cellulari o subcellulari sono stati difficili, principalmente a causa della Locat fisicoione del cuore e la scarsa penetrazione degli anticorpi.
Qui vi presentiamo un metodo per affrontare questi colli di bottiglia da dissezionare il cuore e poi condurre il processo di colorazione sulla superficie di un vetrino da microscopio. Per prevenire la perdita dei campioni piccolo cuore e da facilitare la manipolazione soluzione, abbiamo ristretto il cuore dei campioni all'interno di un cerchio sulla superficie del microscopio diapositive tratte da una penna immEdge. Dopo la colorazione, i segnali di fluorescenza può essere osservata direttamente da un microscopio composto.
Il nostro nuovo metodo migliora significativamente la penetrazione per gli anticorpi, perché un cuore da un pesce embrionale costituito solo da pochi strati di cellule. Immagini di alta qualità dal cuore intatto può essere ottenuto in tempi molto ridotti per la processione embrioni di zebrafish anni dal giorno 2 al giorno 6. Il nostro metodo può essere potenzialmente esteso a macchia di altri organi sezionati sia da zebrafish o altri piccoli animali.
Protocollo
1. Preparazione di diapositive e da camera umidificata
- La camera umidificata può essere fatto da una scatola, come una scatola di punta svuotato. Avvolgere sia la camera e la copertura con fogli di alluminio per proteggere i campioni dalla luce.
- All'interno della camera, mettere un mucchio di tovaglioli di carta bagnata per mantenere l'umidità all'interno della camera, che impedirà i campioni cuore si asciughi. Impostare un micropiastre piccolo sulla sommità del tovagliolo di carta come una rastrelliera per le diapositive.
- Disegnare sia le linee o cerchi sulla superficie di un vetrino da microscopio utilizzando la penna immEdge per fare....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Rispetto ai metodi classici montare tutto immunostaining, il nostro metodo ha i seguenti vantaggi. In primo luogo, molto più forte dei segnali fluorescenti possono essere congruenti a causa di una migliore penetrazione. Nel metodo tutto immunostaining monte, il tessuto cutaneo denso che circonda il cuore ha ridotto significativamente la penetrazione di molti anticorpi, nel fondo di elevata in tutto il corpo. Questo problema è particolarmente grave per gli embrioni di età superiore ai 3 giorni di post-fertilizzazione (DP.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Beninio Jomok per il suo aiuto in zebrafish allevamento. Questo lavoro è finanziato dal NIH HL81753.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| tricaine | Organici di ricerca | 3007T | |
| Formaldeide | Polysciences | 04018 | |
| Siringa di insulina | Becton Dickinson | 329461 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Anti-β-catenina anticorpi | Sigma | C7207 | |
| Anticorpi anti-Mef2c | Santa Cruz Biotech | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinina anticorpi | Sigma | A7811 | |
| Anticorpi anti-Ilk | Segnalazione cellulare | # 3862 | |
| Alexa fluor 568 capra anti IgG di coniglio td> | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 capra anti IgG1 di topo | Invitrogen | A21121 | |
| Mezzo di montaggio per fluorescenza | Vettore | H-1200 | |
| ImmEdge penna | Vettore | H-4000 | |
| Poli-L-lisina vetrini rivestiti | Microscopia elettronica a scienze | 63410-01 | |
| Microscopio copertura in vetro | Pescatore | 12-543-D | |
| Vetrini da microscopio concavo | Pescatore | 7-1305-8 | |
| Dissezione microscopio | Leica MZ95 | ||
| Microscopio composto | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 x PBS
0,5% Triton-X 100
400 mg Tricaine
97,9 mL DDH 2 O
2,1 ml (1M Tris pH9)
Regolare il pH a 7,0
Riferimenti
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoe....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
