血管钙的可视化 2 +信号旁分泌源性活性氧引发
Summary
一种有效的方法获得可视化的旁分泌衍生活性氧诱导内皮细胞Ca2 +信号的见解的描述。这种方法测量旁分泌衍生活性氧引发共培养模型在血管内皮细胞内Ca2 +动员的优势。
Abstract
氧化应激有牵连的一些包括缺血/再灌注损伤和败血症的病理条件。氧化应激的概念是指异常形成的活性氧（活性氧），其中包括 Ø 2• – ，H 2 O 2，和羟基自由基。活性氧的影响多种细胞过程，包括信号转导，细胞增殖和细胞死亡 1-6 。活性氧有可能直接损伤血管和器官的细胞，并能启动中学的化学反应和遗传变异，最终导致初始ROS介导的组织损伤的放大。放大级联，加剧了不可逆的组织损伤的一个关键组成部分是招募和循环炎性细胞的激活。在炎症，炎性细胞产生细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNFα）和IL – 1，激活内皮细胞（EC）和上皮细胞，并进一步增强炎症反应 7 。血管内皮功能障碍是一种急性炎症的建立功能。巨噬细胞促进血管内皮功能障碍，在炎症的机制仍不清楚。 • –和各种促炎性细胞因子，从而触发在相邻细胞的病理信号 8激活巨噬细胞外释放的O 2的结果。 NADPH氧化酶是ROS的主要的主要来源，在大多数的细胞类型。最近，它是我们和其他9,10所示，由NADPH氧化酶产生的活性氧诱导线粒体ROS在许多病理生理条件的生产。因此，测量线粒体ROS产生同样重要的是，除了测量胞质ROS的。巨噬细胞产生ROS的黄素酶NADPH氧化酶在炎症反应中起着主要作用。一旦被激活，吞噬细胞NADPH氧化酶产生丰富的O 2• – 11,12在宿主防御机制的重要。虽然旁分泌衍生Ø 2• –扮演重要的作用，在血管疾病的发病机制，包括CA 2旁分泌ROS诱导的细胞内信号可视化 +动员仍然是假说。我们已经开发出了激活巨噬细胞作为氧源•使用模型–信号转导的一个相邻的内皮细胞。使用这个模型，我们表明，巨噬细胞源性Ø 2• -在邻近的内皮细胞钙信号。
Protocol
Discussion
这里介绍的方法，允许快速和定量测量活性氧，在活细胞使用的氧化敏感的染料或质粒传感器。的Toll样受体激动剂（Toll样受体）的化合物，通过TLRs的细胞表面上的刺激细胞和触发下游信号通路15。在我们的协议中，我们使用三种不同的TLR激动剂，即，锂，磷壁酸TLR2激动剂;聚（I：C）。TLR3激动剂; LPS – TLR4的激动剂据报道，作为一个模型系统诱导ROS证明活性氧测量。使用氧化剂敏感染料的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持批卫生研究院（R01 HL086699，HL086699 01A2S1，1S10RR027327 – 01）的MM。我们的文章部分是由卡尔蔡司显微成像公司的支持。
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
Riferimenti
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