Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS
Summary
Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.
Abstract
Lo stress ossidativo è stato implicato in una serie di condizioni patologiche tra cui ischemia / riperfusione danni e sepsi. Il concetto di stress ossidativo si riferisce alla formazione aberrante di ROS (specie reattive dell'ossigeno), che includono O 2 • -, H 2 O 2, e di radicali idrossili. Specie reattive dell'ossigeno influenza una moltitudine di processi cellulari tra cui trasduzione del segnale, proliferazione cellulare e la morte delle cellule 1-6. ROS hanno il potenziale di danno vascolare e le cellule degli organi direttamente, e può avviare reazioni chimiche secondarie e alterazioni genetiche che alla fine risultare in un ampliamento del periodo iniziale di ROS-mediate danni ai tessuti. Una componente chiave della cascata di amplificazione che aggrava un danno irreversibile del tessuto è il reclutamento e l'attivazione delle cellule infiammatorie circolanti. Durante l'infiammazione, le cellule producono citochine infiammatorie come il tumor necrosis factor-α (TNF) e IL-1 cheattivare le cellule endoteliali (CE) e le cellule epiteliali e ulteriormente aumentare il 7 risposta infiammatoria. Disfunzione endoteliale vascolare è una caratteristica consolidata di infiammazione acuta. Macrofagi contribuire alla disfunzione endoteliale durante l'infiammazione con meccanismi che rimangono poco chiari. Attivazione dei macrofagi risultati nel rilascio extracellulare di O 2 • – e varie citochine pro-infiammatorie, che attiva segnali patologici nelle celle adiacenti 8. NADPH ossidasi sono la fonte principale e primario di ROS nella maggior parte dei tipi di cellule. Recentemente, è dimostrato da noi e gli altri 9,10 che ROS prodotta da NADPH ossidasi indurre la produzione mitocondriale di ROS durante molte condizioni fisiopatologiche. Quindi misurando la produzione mitocondriale di ROS è altrettanto importante oltre a misurare citosolico ROS. I macrofagi producono ROS dalla NADPH ossidasi enzima flavoproteina che svolge un ruolo primario nel processo infiammatorio. Una volta attivato,NADPH ossidasi fagocitica produce grandi quantità di O 2 • – che sono importanti nel meccanismo di difesa dell'ospite 11,12. Anche se paracrino derivati O 2 • – gioca un ruolo importante nella patogenesi delle malattie vascolari, la visualizzazione di segnali paracrini intracellulare di ROS-indotta tra Ca 2 + mobilitazione è ancora un'ipotesi. Abbiamo sviluppato un modello in cui vengono utilizzati macrofagi attivati come fonte di O 2 • – per trasdurre un segnale adiacente cellule endoteliali. Utilizzando questo modello abbiamo dimostrato che macrofagi derivati O 2 • – portare al calcio di segnalazione in cellule endoteliali adiacenti.
Protocol
Discussion
Il metodo qui descritto consente di misurare rapidamente e quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno nelle cellule viventi sia utilizzando coloranti ossidazione sensibili o sensori plasmide. Agonisti dei TLR (Toll-like receptors) sono composti che stimolano le cellule attraverso il TLR presenti sulla superficie cellulare e attivare le vie di segnalazione a valle 15. Nel nostro protocollo, abbiamo utilizzato tre diversi cioè TLR agonisti, Lipo-teichoic acido-TLR2 agonista, Poli (I: C). TLR3-agonist…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di sovvenzione (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Il nostro articolo è in parte supportato da Carl Zeiss Microimaging LLC.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | A8674 |
| DMEM low glucose medium | Invitrogen | 10567-014 |
| Endothelial growth factor supplement (ECGS) | Upstate | 02-102 |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12662011 |
| G418 | Invitrogen | 10131-027 |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 |
| H2DCFDA | Invitrogen | D-399 |
| LPS | Sigma Aldrich | L4516 |
| LTA | Sigma Aldrich | L2515 |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 51985091 |
| Pen/Strep (10x) | Invitrogen | 15140163 |
| pHyPer-cyto | Evrogen | FP941 |
| pHyPer-dMito | Evrogen | FP942 |
| Poly(I:C) | Sigma Aldrich | P0913 |
| Prism software 5.0 | GraphPad Software, Inc. | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat software, Inc. | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400054 |
| T-25 Flasks | Corning | 430639 |
| T-75 Flasks | BD Falcon | 353136 |
| 96-well TC micro well plate | BD Falcon | 353072 |
| Zen 2009 software | Carl Zeiss 510 Meta confocal microscopy |
Riferimenti
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