Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme
Summary
Biz daha iyi bir yaklaşım knock-in ve spektral kullanarak reseptör floresan protein etiketleme dahil yaklaşımların bir arada kullanılarak nikotin bağımlılığı mekanizmalarını anlamak için MSS nöron spesifik alt tiplerinin Subselüler bölgeler içinde nikotinik asetilkolin reseptör değişiklikleri nicel yeni bir teknik geliştirdik konfokal görüntüleme.
Abstract
Merkezi sinir sistemi (MSS) ligand kapılı iyon kanalları ciddi tıbbi ve sosyal sonuçları ile sayısız koşullarda sorumlu tutulmaktadır. Örneğin, sigara ile nikotin bağımlılığı erken ölümü tüm dünyada (Dünya Sağlık Örgütü) önde gelen nedenidir ve büyük olasılıkla beyinde 1 iyon kanal dağıtım bir değişikliğe neden olur. 1-3 beyin dokusunda nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) sayısı artırılmış hem de kemirgenler ve insanlarda sonuçlar kronik nikotin maruziyeti. Benzer şekilde, glutamaterjik GluN1 veya GluA1 kanalları değişiklikler gibi kokain, amfetamin ve opiatların 4-6 gibi diğer bağımlılık yapan ilaçlara duyarlılığın tetiklenmesi suçlanmıştır.
Sonuç olarak, spesifik iyon kanalları dağıtım ve ifade kalıpları eşleştirmek ve sayısal yeteneği bağımlılık mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Beyin bölgeye özgü ef çalışmabireysel ilaçların fects bu radyoaktif ligand olarak tekniklerinin ortaya çıkmasıyla tarafından geliştirilmiştir. Bununla birlikte, radyoaktif ligandı bağlama düşük uzaysal çözünürlüğü nöronların belirli alt türleri olarak ligand kapılı iyon kanalları ölçmek yeteneği önler.
Böyle yeşil floresan protein (GFP) ve birçok renk çeşidi olarak genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere, biyoloji 7 alanında devrim yarattı. Genetik etiketleyerek bir in vivo 7-10 proteinlerin görselleştirebilirsiniz endojen bir protein için bir floresan muhabiri. Bir prob ile floresan etiketleme proteinlerin bir avantajı nonspecificity ve hedef proteine erişilebilirlik sorunları var antikor kullanımının ortadan kaldırılması vardır. Biz transfekte Kültür hücrelerinde 11 Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanarak reseptör montaj çalışması etkin floresan etiketi nAChRs, bu stratejiyi kullanmışlardır. Daha yakın zamanlarda, biz Knoc kullandıkk-spektral konfokal mikroskopi 12 üzerinden MSS nöronlarda submicrometer çözünürlükte reseptör ex vivo hassas ölçümü sağlayan α4 nAChR alt birimden (α4YFP) tagged sarı floresan protein ile mühendis farelere yaklaşımı. Hedeflenen flüoresan zincirleme mutasyon wild tip farelerde etiketsiz reseptörlerine göre ifade ve reseptör düzenlenmesi normal seviyede üreten, endojen odağı ve onun doğal arttırıcının kontrolü altında dahil edilir. Bu çarpık yaklaşım floresan diğer iyon kanalları etiketlemek için genişletilmiş ve MSS reseptörleri görselleştirilmesi ve nicel güçlü bir yaklaşım sunuyor olabilir.
Bu yazıda kronik nikotin maruz kaldıktan sonra özel MSS nöronlarda nAChR ifade değişikliklerini ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bizim yöntemleri mini ozmotik pompa implantasyonu, intrakardiyak perfüzyon fiksasyon, görüntüleme ve floresan etiketli nikotinik rec analizini içerirden eptor altbirimleri α4YFP knock-in fare (Şekil 1). Biz detaylı doğru α4YFP floresan sinyal elde etmek için autofluoresent sinyali çıkarmak için doğrusal bir spektral Karışmama algoritması ile birlikte bir spektral konfokal mikroskop kullanarak bizim görüntüleme yöntemi tarif sabit beyin tissue.We gelen otofloresans en aza indirmek için fiksasyon tekniği optimize etmiş. Son olarak, hipokampüsün medyal perforant yolu α4YFP reseptörlerinin Kronik nikotin ile endüklenen uyarılması sonuçlarını göstermektedir.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anthony Renda Victoria Yüksek Lisans Burs Ödülü bir üniversite tarafından desteklenmiştir. Myre ve Winifred Sim Fonu, İnovasyon hibe, bir British Columbia Bilgi Geliştirme Fonu için bir Kanada Vakfı – Bu araştırma, Doğa Bilimleri ve Kanada Discovery Hibe Mühendislik Araştırma Kurumu, bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü (RN), bir Victoria Vakfı tarafından desteklenen ve Doğa Bilimleri ve Kanada Araştırma Araçları ve Enstrümantasyon Hibe Mühendislik Araştırma Konseyi. Biz mükemmel fare hayvancılık Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald ve Daniel Morgado teşekkür ederiz.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| mini-osmotic pumps | Alzet | model 2002 | |
| saline | Teknova | S5819 | |
| (-)-nicotine hydrogen tartrate salt | Sigma | N5260 | |
| eye drops | Novartis | Tear-Gel | |
| Vetbond glue | 3M | 1469SB | |
| heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| 10x PBS | Invitrogen | 70011 | |
| ketamine | Wyeth Animal Health | 0856-4403-01 | |
| medatomidine hydrochloride | Pfizer | 1950673 | |
| 23G butterfly needle | Becton Dickinson | 367253 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| plastic embedding mold | VWR | 18986-1 | |
| O.C.T. Mounting Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Mowiol 4-88 | EMD-Calbiochem | 475904 | pH 8.5 |
References
- Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).
- Schwartz, R. D., Kellar, K. J. Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo. Science. 220, 214-216 (1983).
- Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).
- Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse. Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).
- Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents. J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).
- Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons. Neuron. 37, 577-5782 (2003).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).
- Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional α4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
- Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy. BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).
- Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E., Periasamy, A., Day, R. N. . Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy. , 180-192 (2005).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Larson, J. M. The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed. Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).
- Melvin, N. R., Sutherland, R. J. Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs. J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).
- Jones, I. W., Wonnacott, S. Why doesn’t nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out. Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).
- Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures. J. Neurochem. , (2007).
- Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression. The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).
- Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).
- Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment. Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).
- King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration. Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).
- Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine. Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).
- Sparks, J. A., Pauly, J. R. Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice. Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).
- Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study. Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).
- Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391, 173-177 (1998).
- Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake. Nature. 471, 597-601 (2011).
- Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436, 103-107 (2005).
- Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research. Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).
- Lang, T., Rizzoli, S. O. Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures. Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).
