Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Sommario

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Abstract

Il test di adesione micropipetta è stato sviluppato nel 1998 per misurare bidimensionali (2D), recettore-ligando cinetica di legame ^1. Il test utilizza un globulo rosso umano (RBC) come sensore di adesione e delle cellule che si presentano per una delle molecole interagenti. Impiega micromanipolazione per portare il RBC in contatto con un'altra cellula che esprime l'altra molecola che interagisce con zona controllata con precisione e tempo per consentire la formazione di legame. L'evento viene rilevato come l'adesione allungamento RBC su tirando le due celle di distanza. Controllando la densità dei ligandi immobilizzato sulla superficie dei globuli rossi, la probabilità di adesione è tenuto in mid-range compreso tra 0 e 1. La probabilità di adesione è stimata dalla frequenza di eventi adesione in una sequenza di cicli ripetuti contatti tra le due cellule per un dato tempo di contatto. Variando il tempo di contatto genera una curva vincolante. Montaggio di un modello probabilistico per recettore-ligando cinetica di reazione ¹ al legamecurva restituisce l'affinità 2D e off-rate.

Il test è stato validato mediante interazioni dei recettori Fcy con IgG Fc ^1-6, selectine con leganti glicoconiugato ^6-9, integrine con leganti ^10-13, homotypical vincolante caderina ^14, recettore delle cellule T e corecettore con peptide-grandi complessi di istocompatibilità ^{15 - 19.}

Il metodo è stato utilizzato per quantificare regolamenti della cinetica 2D da fattori biofisici, come ad esempio la membrana microtopology ^5, della membrana di ancoraggio ^2, orientamento molecolare e lunghezza ^6, rigidità vettore ^9, curvatura ^20, e la forza impingement ^20, così come i fattori biochimici, come modulatori del microambiente citoscheletro e membrana in cui le molecole interagiscono risiedono e l'organizzazione della superficie di queste molecole ^15,17,19.

Il metodo è stato utilizzato anche to studiare il legame simultaneo di doppio recettore-ligando specie ^3,4, e le interazioni trimolecular ¹⁹ con un modello modificato ^21.

Il principale vantaggio del metodo è che permette lo studio dei recettori di membrana nel loro ambiente nativo. I risultati potrebbero essere molto diversi da quelli ottenuti con recettori purificati ^17. Consente inoltre lo studio del recettore-ligando interazioni in un lasso di tempo inferiori al secondo con risoluzione temporale ben oltre i tipici metodi biochimici.

Per illustrare l'adesione metodo micropipetta frequenza, ci mostrano la misurazione cinetica della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) funzionalizzati su globuli rossi legame β integrina α _{L 2} sui neutrofili con dimerica E-selectina nella soluzione per attivare α β _{L 2.}

Protocollo

1. Isolamento globuli rossi del sangue intero

1. Preparare EAS-45 soluzioni. Pesare tutti gli ingredienti dalla tabella I e sciogliere in 100-200ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua per rendere la soluzione 1000ml e aggiustare il pH a 8,0. Filtro e aliquota da 50ml. Congelare a -20 ° C per la conservazione.

Nota: Passo 1,2 dovrebbe essere eseguita da un medico addestrato ad esempio come infermiera, con un Institutional Review Board protocollo approvato.

2. Disegna 3-5ml di sangue dalla vena cubitale mediana in una provetta da 10 ml contenente EDTA e delicatamente mescolare il sangue ....

Discussione

Per utilizzare con successo l'adesione saggio micropipetta frequenza si dovrebbe considerare diversi passaggi critici. Per prima cosa, assicurarsi di registrare l'interazione specifica per il recettore-ligando sistema di interesse. Misure di controllo non specifici (cfr. fig. 3, 4) garantire la specificità. Idealmente, le probabilità di adesione non specifica deve essere inferiore a 0,05 per durate di tempo tutti i contatti e di avere una significativa differenza tra le probabilità di adesione specifici e non specifici .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Catalogo #	Commenti
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Diluire a 1x con acqua deionizzata prima dell'uso
Vacutainer EDTA	BD	366643	RBC isolamento
10ML PK100
HISTOPAQUE 1077	Sigma-Aldrich	10771	RBC isolamento
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 preparazione
D-glucosio (destrosio)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 preparazione
D-mannitolo	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 preparazione
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 preparazione
Fosfato di sodio, bibasico (Na & # x2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 preparazione
L-glutammina	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 preparazione
Biotina-X-NHS	Calbiochem	203188	RBC biotinilazione
Dimetilformammide (DMF)	Thermo Scientific	20673	RBC biotinilazione
Borato Buffer (0,1 M)	Electron Microscopy Sciences	11455-90	RBC biotinilazione
Streptavidina	Thermo Scientific	21125	Ligand funzionalizzazione
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand funzionalizzazione
Quantibrite PE Perline	BD Biosciences	340495	Densità di quantificazione
Citometro a flusso	BD Immunocytometry Sistemi	BD LSR II	Densità di quanidentificazione
Tubo capillare 0,7-1.0mm x 30 "	Kimble Glass Inc.	46485-1	Micropipetta tirando
Olio minerale	Fisher Scientific	BP2629-1	Camera di montaggio
Microscopio copertura in vetro	Fisher Scientific	12-544-G	Camera di montaggio
PE-α umano CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	Reagente per Fig.1
PE anti-CD54 umano	eBioscience	12-0549	Reagente per Fig.1
IgG1 Isotipo controllo PE	eBioscience	12-4714	Reagente per Fig.1
micromanipolatore idraulico	Narishige	MO-303	Micropipetta sistema
Manipolatore meccanico	Newport	461-xyz-m, SM-13, DM-13	Micropipetta sistema
traduttore piezoelettrico	Physik Instrumente	P-840	Micropipetta sistema
LabVIEW	National Instruments	Versione 8.6	Micropipetta sistema
Scheda DAQ	National Instruments	USB-6008	Micropipetta sistema
Tavolo ottico	Cinetica Sistemi	Serie 5200	Micropipetta sistema