תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.
Assay הידבקות micropipette פותחה בשנת 1998 על מנת למדוד דו ממדי (2D) קולטן ליגנד קינטיקה מחייב 1. Assay משתמשת תא אנושי דם אדומים (RBC) כמו חיישן הידבקות התא הצגת אחד של מולקולות אינטראקציה. היא מעסיקה המיקרומניפולציה להביא את RBC במגע עם תא אחר המבטא את המולקולה אינטראקציה עם אחרים לאזור שבשליטת בדיוק הזמן כדי לאפשר היווצרות הקשר. האירוע הידבקות מזוהה כמו התארכות RBC על משיכת שני תאים בנפרד. על ידי שליטה על צפיפות של ligands משותקת על פני השטח RBC, ההסתברות של הידבקות נשמר בטווח אמצע בין 0 ל -1. ההסתברות הידבקות מוערך של תדירות האירועים הידבקות ברצף מחזורים חוזרים ונשנים ליצור קשר בין שני תאים לזמן קשר נתון. משנים את זמן מגע יוצר עקומת מחייב. התאמת מודל הסתברותי לתגובת קולטן ליגנד קינטיקה 1 ל מחייבעקומת מחזירה את הזיקה 2D and off-קצב.
Assay יאומת באמצעות אינטראקציות של רצפטורים Fcγ עם IgG Fc 1-6, selectins עם ligands glycoconjugate 6-9, 10-13 integrins עם ligands, homotypical cadherin מחייב 14, קולטן T התא coreceptor עם פפטיד הגדולות מתחמי histocompatibility 15 – 19.
בשיטה נעשה שימוש כדי לכמת תקנות קינטיקה 2D ידי גורמים biophysical, כגון הממברנה microtopology 5, קרום עוגן 2, אוריינטציה מולקולרית באורך 6, קשיחות המוביל 9, עקמומיות 20, 20 ו – כוח פגיעה, כמו גם גורמים ביוכימיים, כגון מאפננים של microenvironment cytoskeleton ואת הקרום שבו מולקולות אינטראקציה מתגוררים וארגון פני השטח של המולקולות הללו 15,17,19.
השיטה גם שימש to המחקר מחייב במקביל של קולטן ליגנד מינים כפול 3,4, ואת האינטראקציות trimolecular 19 באמצעות מודל שונה 21.
היתרון העיקרי של השיטה הוא שהיא מאפשרת מחקר של קולטני בסביבת קרום האם שלהם. התוצאות יכול להיות מאוד שונים מאלו שהושגו באמצעות קולטנים מטוהרים 17. זה גם מאפשר לימוד של קולטן ליגנד אינטראקציות זמנים המשנה השני עם רזולוציה הזמני הרבה מעבר שיטות ביוכימיות טיפוסיות.
כדי להמחיש את שיטת הדבקה micropipette תדר, אנו מראים מדידה קינטיקה של מולקולת הדבקה אינטר 1 (ICAM-1) על פונקציונליות RBCs מחייב β integrin L α 2 על נויטרופילים עם dimeric E-selectin בפתרון להפעיל α β L 2.
כדי להשתמש בהצלחה את הידבקות micropipette תדירות assay אחד צריך לשקול צעדים קריטיים מספר. ראשית, ודא כדי להקליט את האינטראקציה ספציפי למערכת קולטן ליגנד של עניין. מדידות בקרה ספציפי (ראה איור. 3, 4) להבטיח את הספציפיות. באופן אידיאלי, הסתברויות הדבקה ספציפי צריך להיות מתחת 0.05 עב…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקים R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 ו R01GM096187.
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
---|---|---|---|
10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
10ML PK100 | |||
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |