Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia
Summary
Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.
Abstract
Il test di adesione micropipetta è stato sviluppato nel 1998 per misurare bidimensionali (2D), recettore-ligando cinetica di legame 1. Il test utilizza un globulo rosso umano (RBC) come sensore di adesione e delle cellule che si presentano per una delle molecole interagenti. Impiega micromanipolazione per portare il RBC in contatto con un'altra cellula che esprime l'altra molecola che interagisce con zona controllata con precisione e tempo per consentire la formazione di legame. L'evento viene rilevato come l'adesione allungamento RBC su tirando le due celle di distanza. Controllando la densità dei ligandi immobilizzato sulla superficie dei globuli rossi, la probabilità di adesione è tenuto in mid-range compreso tra 0 e 1. La probabilità di adesione è stimata dalla frequenza di eventi adesione in una sequenza di cicli ripetuti contatti tra le due cellule per un dato tempo di contatto. Variando il tempo di contatto genera una curva vincolante. Montaggio di un modello probabilistico per recettore-ligando cinetica di reazione 1 al legamecurva restituisce l'affinità 2D e off-rate.
Il test è stato validato mediante interazioni dei recettori Fcy con IgG Fc 1-6, selectine con leganti glicoconiugato 6-9, integrine con leganti 10-13, homotypical vincolante caderina 14, recettore delle cellule T e corecettore con peptide-grandi complessi di istocompatibilità 15 – 19.
Il metodo è stato utilizzato per quantificare regolamenti della cinetica 2D da fattori biofisici, come ad esempio la membrana microtopology 5, della membrana di ancoraggio 2, orientamento molecolare e lunghezza 6, rigidità vettore 9, curvatura 20, e la forza impingement 20, così come i fattori biochimici, come modulatori del microambiente citoscheletro e membrana in cui le molecole interagiscono risiedono e l'organizzazione della superficie di queste molecole 15,17,19.
Il metodo è stato utilizzato anche to studiare il legame simultaneo di doppio recettore-ligando specie 3,4, e le interazioni trimolecular 19 con un modello modificato 21.
Il principale vantaggio del metodo è che permette lo studio dei recettori di membrana nel loro ambiente nativo. I risultati potrebbero essere molto diversi da quelli ottenuti con recettori purificati 17. Consente inoltre lo studio del recettore-ligando interazioni in un lasso di tempo inferiori al secondo con risoluzione temporale ben oltre i tipici metodi biochimici.
Per illustrare l'adesione metodo micropipetta frequenza, ci mostrano la misurazione cinetica della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) funzionalizzati su globuli rossi legame β integrina α L 2 sui neutrofili con dimerica E-selectina nella soluzione per attivare α β L 2.
Protocol
Discussion
Per utilizzare con successo l'adesione saggio micropipetta frequenza si dovrebbe considerare diversi passaggi critici. Per prima cosa, assicurarsi di registrare l'interazione specifica per il recettore-ligando sistema di interesse. Misure di controllo non specifici (cfr. fig. 3, 4) garantire la specificità. Idealmente, le probabilità di adesione non specifica deve essere inferiore a 0,05 per durate di tempo tutti i contatti e di avere una significativa differenza tra le probabilità di adesione specifici e non…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 e R01GM096187.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |
Riferimenti
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